【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及农业领域。更具体而言，本专利技术提供了在转基因植物的基因组中精确定位的核苷酸序列上导入定向修饰的方法和工具，所述修饰包括插入、缺失或取代，其中核苷酸序列包含在植物转基因中常用的元件或DNA片段中，所述元件或DNA片段例如常用的可选择的标志物基因。在识别核苷酸序列处使用源自天然存在的大范围核酸酶、并经过重新设计而识别识别位点并对其进行切割的大范围核酸酶，诱导双链断裂，通过其在第一步触发修饰。
技术介绍
在植物基因组中导入定向修饰的需求(包括控制外来DNA在植物中整合的位置)已变得日益重要，为了满足这一需求，已开发了若干方法(综述参见Kumar和Fladung，2001, Trends in Plant Science, 6,第155-159页)。这些方法大部分依赖于在定向位置初始导入双链DNA断裂。通过切点罕见内切核酸酶(如1-SceI)诱导双链DNA断裂，激活靶基因座和/或修复(repair)或贡献(donor) DNA,表现出增加若干数量级的同源重组频率。(Puchta等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，93，第 5055-5060 页；Chilton 和 Que，Plant Physiol.，2003 ;D，Halluin 等人，2008Plant Biotechnol.J.6，93-102)。W096/14408描述了编码酶Ι-Scel的分离的DNA。该DNA序列可以被掺入到克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。载体可用于基因定位和基因的定点插入。W000/46386描述了通过1-SceI诱导的双链...
【技术保护点】
向植物细胞的基因组的预定位点导入外来DNA分子的方法，包括步骤：a.在所述预定位点诱导双链DNA断裂；b.将所述外来DNA分子导入所述植物细胞中；和c.选择在所述预定位点导入了所述外来DNA的植物细胞；特征是所述预定位点包含在编码吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)编码的膦丝菌素乙酰转移酶的DNA区域(bar编码区)内，且所述双链DNA断裂的诱导是通过导入单链大范围核酸酶或成对大范围核酸酶，所述大范围核酸酶识别或一致识别所述预定位点并诱导所述双链断裂。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.09 EP 10005941.9;2010.06.17 US 61/3558491.向植物细胞的基因组的预定位点导入外来DNA分子的方法，包括步骤: a.在所述预定位点诱导双链DNA断裂； b.将所述外来DNA分子导入所述植物细胞中；和 c.选择在所述预定位点导入了所述外来DNA的植物细胞； 特征是所述预定位点包含在编码吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)编码的膦丝菌素乙酰转移酶的DNA区域(bar编码区)内，且所述双链DNA断裂的诱导是通过导入单链大范围核酸酶或成对大范围核酸酶，所述大范围核酸酶识别或一致识别所述预定位点并诱导所述双链断裂。2.根据权利要求1的方法，其中所述预定位点包含SEQID N0.1或SEQ ID N0.2的核苷酸序列。3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述bar编码区包含SEQID N0.:3的核苷酸序列。4.向植物细胞的基因组的预定位点导入外来DNA分子的方法，包括步骤: a.在所述预定位点诱导双链DNA断裂； b.将所述外来DNA分子导入所述植物细胞中；和 c.选择在所述预定位点导入了所述外来DNA的植物细胞； 特征是所述预定位点包含SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2的核苷酸序列，且所述双链DNA断裂的诱导是通过导入单链大范围核酸酶或成对大范围核酸酶，所述大范围核酸酶识别或一致识别所述预定位点并诱导所述`双链断裂。5.根据权利要求1至4的任一项的方法，其中所述大范围核酸酶或所述成对大范围核酸酶源自1-Crel，且其中大范围核酸酶单元I中存在下列氨基酸: a.第32位S; b.第33位Y; c.第38位E; d.第40位R; e.第66位K; f.第80位Q; g.第42位T; h.第77位R;68位R; j.第70位R ; k.第44位Q ;24位I ; m.第26位S ; η.第28位S ; ο.第30位R， 且其中大范围核酸酶单元2中存在下列氨基酸: P.第70位R ; q.第44位T ;r.第24位I ; s.第26位S ; t.第28位S ; u.第30位N ; V.第32位S ; w.第33位R ; X.第38位Q ; y.第80位Q ; z.第40位R ; aa.第 66 位 K ; bb.第 42 位 T ;CC.第 77 位 R ;dd.第 68 位 R06.根据权利要求1至5的任一项的方法，其中所述成对大范围核酸酶强制性的形成异二聚体，或其中所述大范围核酸酶是包含通过接头共价连接的、2个1-CreI来源的结构域的单链大范围核酸酶。7.根据权利要求1至6的任一项的方法，其中所述成对大范围核酸酶分别包含SEQIDN0.5和SEQ ID N0.6的氨基酸 序列，或所述单链大范围核酸酶包含SEQ ID N0.18的自第I至167位和自第206至362位的氨基酸序列。8.根据权利要求1至7的任一项的方法，其中所述成对大范围核酸酶是由这样的核酸编码的，所述核酸包含SEQ ID N0.4的第2004位核苷酸至第2525位核苷酸或至第2522位核苷酸的核苷酸序列，和SEQ ID N0.4的第4885位核苷酸至第5405位或第5403位核苷酸的核苷酸序列，或所述单链大范围核酸酶是由这样的核酸分子编码的，所述核酸分子包含SEQ ID N0.17的第1267至1605位和第1795至1956位和第2071至2541位核苷酸的核苷酸序列，或所述单链大范围核酸酶是由这样的核酸分子编码的，所述核酸分子包含SEQ IDN0.17的第1267至1605位和第1795至2541位核苷酸的核苷酸序...
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