一种植物双基因共表达载体的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种植物双基因共表达载体的构建方法，其特征在于通过PCR扩增将质粒pGWB605(GenBank登记号AB543114)中的间隔序列两端添加Ncol和EcoR?I内切酶酶切位点后，将间隔序列克隆入pXCS-HAStrep质粒中，构建了植物双基因共表达载体pXCS-Dgene-HAStrep。该表达载体自身仅有5682Kb，可装载两个较大的外源基因，而且两个外源基因能在一套真核表达系统中独立表达。该表达载体采用bar基因做筛选标记基因，转基因植株的筛选操作简单，效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体地说，涉及。
技术介绍
以往植物转基因多是利用单个目的基因改良植物的个别性状，而单个目的基因的转化不能满足植物改良的需要，尤其是对一些代谢途径或数量性状的遗传修饰。随着植物基因工程和分子生物学研究的深入，多基因转化研究应运而生，并迅速发展。目前，植物遗传转化多基因共表达系统通常包括多质粒共转化系统和单个载体表达多个基因表达盒系统。在多质粒共转化系统中，是将多个外源基因分别克隆至不同的抗性载体中，共转化后同时添加多种抗生素实现多基因的共表达，由于受到抗性标记种类及组合方式的限制，这种系统仅能实现少数几个基因的共表达，此外共表达时，还需要考虑两个或多个表达质粒的相容性，操作起来也比较麻烦，且转化效率不是很高。Johnston等在构建pRSET/pRMl相容性双质粒共表达体系的研究中提出，2个载体都要带有T7启动子，并且还要带有不同的抗性；最重要的一点，就是2个载体的复制子不能相同，这样才能保证在传代过程中不会发生质粒的丢失。但是目前大部分商品化表达载体均为ColEl/pMBl复制子，所以不同复制子的2种载体不容易得到，这会给研究工作带来一些麻烦。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物双基因共表达载体的构建方法，其特征在于包括：1)设计引物a.根据待扩增的间隔序列，设计引物，SP?F和SP?R，并在上游引物和下游引物中分别引入Ncol和EcoR?I内切酶酶切位点；b.根据pXCS?HAStrep载体多克隆位点结构特点，设计接头SP?A1和SP?A2；2)载体构建a.以载体pGWB605(GenBank登记号AB543114)为模板，SP?F/SP?R为引物，通过PCR扩增获取间隔序列，产物大小为341bp；b.将扩增产物与pMD?19T载体在16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5a,涂布于含抗生素Carb的LB固体培养基上，37℃培养12h，挑取阳性单克隆，提取质粒...

【技术特征摘要】
1.一种植物双基因共表达载体的构建方法,其特征在于包括: 1)设计引物 a.根据待扩增的间隔序列，设计引物，SP-F和SP-R，并在上游引物和下游引物中分别引入Ncol和EcoR I内切酶酶切位点； b.根据pXCS-HAStr印载体多克隆位点结构特点，设计接头SP-Al和SP-A2； 2)载体构建 a.以载体pGWB605(GenBank登记号AB543114)为模板，SP-F/SP-R为引物，通过PCR扩增获取间隔序列，产物大小为341bp ； b.将扩增产物与PMD-19T载 体在16°C连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5a，涂布于含抗生素Carb的LB固体培养基上，37°C培养12h，挑取阳性单克隆，提取质粒进行测序； c.用内切酶HindIII和EcoR I酶解质粒pXCS_...

【专利技术属性】
技术研发人员：安泽伟，翟琪麟，李雅超，赵建文，谢黎黎，高新生，李维国，黄华孙，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：