抗GM-CSF抗体和其用途制造技术

本发明专利技术提供对在多种疾病或病症中起重要作用的GM-CSF具有特异性的重组抗原结合区、抗体和其功能片段。因此，这些抗体可用于治疗(例如)诸如类风湿性关节炎等炎症性疾病。本发明专利技术抗体也可用于诊断学领域，以及用于进一步研究GM-CSF在多种疾病进展中的作用。本发明专利技术也提供编码前述抗体的核酸序列、包含所述核酸序列的载体、医药组合物和带有使用说明的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】


技术介绍
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)最初称为造血生长因子。其由许多细胞类型产生，包括淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞及一些恶性细胞(Metcalf等人，1986 ；Clark 及 Kamen, 1987 ；Hart 等人，1988 ；Metcalf 等人，1986)。除对造血前驱细胞具有生长刺激及分化功 能外，也发现GM-CSF对表达GM-CSF受体的免疫系统细胞具有多种作用(参见:Hamilton, 2002 ;de Groot等人，1998)。所述功能中最重要的是在数种免疫及发炎过程中对单核细胞、巨曬细胞及粒细胞的激活(Gasson等人，1990b ;Gasson等人，1990a ；Hart 等人，1988 ；Rapoport 等人，1992)。成熟的GM-CSF为含有127个氨基酸具有两个糖基化位点的单体蛋白质。糖基化程度可变导致分子量介于14kDa与35kDa之间。非糖基化及糖基化的GM-CSF显示相似的活体外活性(Cebon等人，1990)。GM-CSF的晶体学分析显示由四个短a螺旋组成的桶状结构(Diederichs等人，1991)。总体折叠与诸如生长激素、白细胞介素_2及白细胞介素_4等其他生长因子相似。GM-CSF通过结合至其受体发挥其生物活性(Kastelein及Sha-nafelt, 1993 ；Sisson及Dinarello，1988)。GM-CSF受体(GM-CSF-R)表达的最重要位点是在骨髓细胞及内皮细胞的细胞表面，而淋巴细胞是GM-CSF-R阴性的。天然受体由至少两个亚单位(a及￠)组成。a亚单位赋予配体特异性并以毫微摩尔亲和力结合GM-CSF (Gearing等人，1989 ;Gasson等人，1986)。P亚单位也为白细胞介素_3及白细胞介素-5受体错合物的一部分并与GM-CSF受体a亚单位及GM-CSF联合导致形成具有微微摩尔结合亲和力的错合物(Hayashida等人，1990)。已对受体在GM-CSF上的结合结构域实施定位:GM_CSF与其受体的P亚单位经由在GM-CSF第一 a螺旋中非常有限的区域相互作用(Shanafelt等人，1991b ;Shanafelt等人，1991a ;Lopez等人，1991)。可将与a亚单位的结合定位至第三a螺旋、螺旋C、与螺旋C及D连接的环的起始残基及GM-CSF的羧端尾部(Brown等人，1994)。GM-CSF三聚体受体错合物的形成导致包括JAK/STAT家族、She、Ras、Raf、MAP激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶及NFkB等分子的错合物信号级联激活，最后导致c-myc、c-fos及c-jun转录。激活主要由受体的P亚单位引起(Hayashida等人，1990 ;Kitamura等人，1991 ;Sato等人，1993)。共享的P亚单位也是IL_3、IL-5及GM-CSF发挥的叠加功能的原因(参见de Groot等人，1998)。除其造血生长和分化刺激活性外，GM-CSF尤其起促炎性细胞因子的作用。巨噬细胞和单核细胞以及中性白细胞和嗜曙红细胞由GM-CSF激活，导致释放其他细胞因子及趋化因子、基质降解蛋白酶，HLA表达增加及CC-趋化因子受体或细胞粘附分子的表达增力口。同样，后者又导致炎症细胞成发炎组织的趋化性增加(Chantry等人，1990 !Hamilton,2002 ；Sisson 及 Dinarello, 1988 ； Zhang 等人，1998 ； Hami I ton 等人，1993 ； Lopez 等人，1986 ；Cheng 等人，2001 ；Gomez-Cambronero 等人，2003)。通常，GM-CSF 协同其他炎症性刺激因子(例如其他细胞因子或LPS)发挥其活性，例如用GM-CSF与(例如)LPS联合处理的中性白细胞会显示增加的氧化爆发(Kaufman等人,1989 ；Rapoport等人,1992)。GM-CSF作为抗炎疗法的靶点:由于其在免疫系统中的多种激活功能，GM-CSF可视为抗炎疗法的靶点。诸如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、克罗恩(Crohn' s)病、牛皮癣、哮喘病、特应性皮炎或休克等慢性及急性炎症性疾病可充分受益于GM-CSF活性的阻断及随后GM-CSF反应细胞有害活性的降低(Hamilton, 1993 ；Zhang 等人，1998 ；Hamilton, 2002)。关节炎:数个组已证实GM-CSF以及其受体存在于关节炎患者的滑膜关节中(Alvaro-Gracia 等人，1991 ；Xu 等人，1989 ；Haworth 等人，1991)。此外，证实 GM-CSF 在用GM-CSF治疗费耳提氏(Felty' s)综合症中的嗜中性白细胞减少症的患者中(Hazenberg等人，1989)或于化学疗法后(de Vries等人，1991)引起突发类风湿性关节炎。阻断GM-CSF的抗体治疗关节炎有效性的最初线索来自小鼠活体内研究(Campbell 等人，1997 ； Campbe 11 等人，1998 ；Cook 等人,2001)。具体来说，Cook 等人证实GM-CSF中和抗体在胶原诱导性关节炎模型中显示功效。GM-CSF阻断可使疾病严重程度减轻，所述疾病严重程度涉及炎症、软骨破坏及在最初受侵袭的肢中的疾病扩散或至其他肢的扩散。抗GM-CSF疗法具有数种患有类风湿性关节炎或患有其他炎症性疾病的患者可受益的效果。期望GM-CSF阻断可抑制或降低:a)成熟单核细胞、巨噬细胞及中性白细胞的激活及数量。具体来说，中性白细胞及巨噬细胞大量存在于滑液及膜中。已证实在滑膜中巨噬细胞的数量与RA关节的糜烂程度有关(Mulherin等人，1996 ；Burmester等人，1997)。巨噬细胞是多种其他促炎性细胞因子及基质降解蛋白酶的来源。由中性白细胞产生H2O2是发生在关节炎关节处破坏性过程的一部分(Babior,2000)。b)骨髓树突细胞(DC)的分化及滑液DC(等于滑膜细胞)的激活。GM-CSF上调并维持HLA II类在DC及RA滑膜细胞上的表达(Alvaro-Gracia JM等人，1991)。在关节内指示DC获得与炎症性T细胞选择性激活相关的功能。已将特异性HLA-DR等位基因与RA易感染性相关联并且经由DC抗原提呈的T细胞激活可在所述类型免疫疾病中起至关重要的作用(Santiago-Schwarz 等人，2001)。多发性硬化症:在多发性硬化症中，GM-CSF水平的提高与MS的症状活跃期有关(Carried等人，1998 ;McQualter等人，2001)并且GM-CSF-/-小鼠未能在MS、实验性脑脊髓炎、EAE的模型系统中感染疾病(McQualter等人，2001)。哮喘病: 已报道在哮喘病中肺中GM-CSF的量增加 !■01(^及？化68七6111，1991)。同时，嗜曙红细胞增加，GM-CSF与白细胞介素-5以三种方式协同作用而导致嗜曙红细胞增加:i)刺激祖细胞分化至嗜曙红细胞；ii)刺激它们的功能激活；及iii)延长嗜曙红细胞在肺中的存活(Broide等人，1992 ;Yamashita等人，2002)。因此，通本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经分离的对人类GM?CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其中所述经分离的人类或人源化抗体或其功能片段能够：(i)在以下条件下将0.5μg/ml人类GM?CSF与在约2x105个CHO?K1细胞上表达的人类GM?CSF受体α链的相互作用阻断至少50％：(a)在所述CHO?K1细胞上表达的所述人类GM?CSF受体α链的浓度与在约2x105个CHO?GMRa#11细胞上表达的人类GM?CSF受体α链的浓度相似；和(b)所述经分离的人类或人源化抗体或其功能片段的浓度为约5μg/ml；以及(ii)在TF?1增殖分析中以比参考抗体BVD2?21C11或MAB215低至少5倍的IC50值中和0.25ng/ml人类GM?CSF。

【技术特征摘要】
2005.05.18 US 60/682,0091.一种经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其中所述经分离的人类或人源化抗体或其功能片段能够: (i)在以下条件下将0.5 ii g/ml人类GM-CSF与在约2xl05个CHO-Kl细胞上表达的人类GM-CSF受体a链的相互作用阻断至少50%: (a)在所述CHO-Kl细胞上表达的所述人类GM-CSF受体a链的浓度与在约2xl05个CH0_GMRa#ll细胞上表达的人类GM-CSF受体a链的浓度相似；和(b)所述经分离的人类或人源化抗体或其功能片段的浓度为约5 u g/ml ；以及 (ii)在TF-1增殖分析中以比参考抗体BVD2-21C11或MAB215低至少5倍的IC5tl值中和 0.25ng/ml 人类 GM-CSF。2.按权利要求1所述的经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段与大鼠GM-CSF和/或恒河猴GM-CSF交叉反应。3.按权利要求1或2所述的经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其中所述人类抗体为合成人类抗体。4.按权利要求1或2所述的经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其为IgG。5.按权利要求1或2所述的经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段， 其为Fab或scFv抗体片段。6.按权利要求1或2所述的经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其中所述经分离的人类或人源化抗体或其功能片段在TF-1增殖分析中以比参考抗体MAB215或BVD2-21C11低至少10倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人类GM-CSF。7.按权利要求1或2所述的经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其中所述经分离的人类或人源化抗体或其功能片段在TF-1增殖分析中以比参考抗体MAB215或BVD2-21C11低至少20倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人类GM-CSF。8.按权利要求1或2所述的经分离的对人类GM-CSF具有特异性的人类或人源化抗体或其功能片段，其中所述经分离的人类或人源化抗体或其功能片段在TF-1增殖分析中以比参考抗体MAB215或BVD2-21C11低至少50倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人类GM-CSF。9.按权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯特凡·施泰德尔，伊丽莎白·托马森沃尔夫，
申请(专利权)人：莫菲西斯公司，
类型：发明
国别省市：