本发明专利技术涉及GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用，具体涉及一种能够用于治疗肿瘤药物的GM-CSF-HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；还包括其制备方法：将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，纯化收集所述的重组蛋白，该重组蛋白可以用于生产治疗肿瘤药物，如乳腺癌，本发明专利技术用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动，GM-CSF-HER2重组蛋白避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用。
【技术实现步骤摘要】
—种GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用本专利技术涉及GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用，具体涉及一种能够用于治疗肿瘤药物的GM-CSF-HER2重组蛋白及其制备方法、制作DC疫苗的方法和应用。 肿瘤发生发展的根本原因之一是机体的免疫系统不能对其生长进行有效地控制，对此加以纠正，使机体的免疫系统能有效产生对肿瘤细胞的免疫排斥反应是近百年来人们一直研究的课题。肿瘤疫苗是该方面研究的主要内容，在众多的肿瘤疫苗中，根据抗原提呈细胞在肿瘤免疫中的重要作用而设计的树突状细胞(dendritic cells, DC)瘤苗是目前研究最热门方向。机体的免疫应答首先由抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)捕获、加工和处理抗原，再将抗原递呈给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为功能最强的APC，能激活静息型T细胞(naive T cell)，激发初始免疫应答，在体内发挥强大的免疫监视功能。肿瘤患者体内DC功能缺陷，不能有效递呈肿瘤抗原，导致免疫无能或免疫耐受，使肿瘤得以发生发展。应用DC瘤苗治疗肿瘤最引人瞩目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏(pulsing) DC，然后将之回输或免疫接种至行瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，已证明该疗法能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应并能治疗已建立的荷瘤模型，这些研究为肿瘤的治疗提供了新的思路，将DC过继回输已在临床用于肿瘤病人的治疗，取得了一定疗效，表明该疗法具有一定的临床应用的可行性。DC的抗原递呈功能是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的基础，DC的体外大量诱导扩增是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的前提，DC瘤苗的体外构建是DC瘤苗的抗肿瘤免疫治疗的关键。随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术和基因工程技术应用于DC瘤苗构建方法的发现，使得产量增大、纯度提高、制备更容易等优点，更能满足实验和临床研究的需要。DC瘤苗用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究更趋成熟，DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。故本专利技术以构建肿瘤特异性抗原结合细胞因子等刺激DC细胞制备DC疫苗可有效激发体内的抗原特异性免疫反应，并用于肿瘤的预防及治疗。针对现阶段应用常规方法所诱导的DC细胞具有抗原特异性不高以及过早凋亡等方面的不足。本专利技术提供了一种GM-CSF-HER2重组蛋白的制备方法，使诱导的DC细胞在抗原特异性和生存周期上都有了很大程度的提高，为后续的特异性免疫应答提供了很好的基础条件。本专利技术为肿瘤免疫治疗奠定了良好的基础。为实现上述目的，设计一种GM-CSF-HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。—种制备上述重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成a.将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，b.重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，c.纯化收集所述的重组蛋白。所述的酶切为在GM-CSF的基因序列两端添加酶切点位Hind III和Xho I，在HER2的基因序列两端添加酶切点位Xho I和BamH I。通过N1-NTA柱进行所述的分离纯化。所述重组蛋白可以用作生产治疗肿瘤的药物。所述的肿瘤为乳腺癌。一种所述重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于用所述的重组蛋白刺激诱导 健康C57BL/6小鼠经由骨髓制备的DC细胞，制得DC疫苗。用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25 100ug/ml。用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25 50ug/ml。与常规利用肿瘤细胞裂解物诱导DC细胞的方法相比，本专利技术具有以下优点(I)利用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了 DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动；(2) GM-CSF-HER2重组蛋白的成功制备，避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用；(3)增强了肿瘤抗原的特异性，针对性的解决了以HER2为标志性抗原的肿瘤免疫治疗，为肿瘤临床治疗提供了新的依据。附图说明图1为不同疫苗刺激机体ELISPOT检测IFN-gama斑点数；图2为不同疫苗刺激机体特异性反应ELISPOT检测IFN-gama斑点；图3为不同组肿瘤块体积对比图；图4为不同剂量重组蛋白刺激机体特异性反应ELISPOT检测分析图；图5为4T1-HER2细胞毒实验比较图；图6为4T1细胞毒实验比较图；图7为质粒pCEP4图谱。图7的图谱详情如下CMV 启动子1-588多克隆位点619-676SV40多腺苷酸化信号位点685-926复制起始位点1344-3319EBNA-1 基因(互补链)位点3620_5545氨苄青霉素抗性基因位点6171-7031复制起始位点7040-7815TK 启动子8183-8345潮霉素抗性基因位点8409-9419TK多腺苷酸化信号位点9431-9702[具体实施方式]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本专利技术进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1:将人乳腺癌细胞SKBr3特异性抗原HER2的特异编码序列与粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF编码序列进行重组。其中，粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF来自NCBI，其序列号为AAA52578，其编码序列为 tqpwehvnai qearrllnls rdtaaemnet vevisemfdl qeptclqtrl elykqglrgs60ltklkgpltm mashykqhcp ptpetscatq i itf esfken lkdfl lvipf dc112GM-CSF基因序列两端加酶切位点Hind III和Xho I ；人乳腺癌细胞SKBr3特异性抗原HER2来自NCBI，其序列号为NP_004439，其编码序列为gcpaeqrasp ltsiisavvg illvvvlgvv fgilikrrqq kirk 44在HER2基因序列两端加酶切位点Xho I和BamH I ；利用基因重组技术将上述两段基因片段通过酶切克隆到质粒pCEP4构建重组质粒，质粒PCEP4图谱如图7所示，；将重组质粒pCEP4转染人胚胎肾293细胞，进行GM-CSF-HER2重组蛋白的表达；然后利用Ni — NTA柱分离纯化GM-CSF-HER2重组蛋白；构建表达人源HER2的小鼠乳腺癌细胞株4T1，即4T1-HER2细胞株，并用RPM1-1640培养基，添加1. 5g/L的NaHCO3, 2. 5g/L的葡萄糖，O. llg/L的丙酮酸钠，10%热灭活的胎牛血清，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素进行培养；选取BALB/C小鼠，构建4T1-HER2动物模型；取健康BALB/C小鼠四肢骨骨髓制备成单细胞悬液，去除红细胞，加入完全培养基、细胞因子，体外诱导出小鼠DC细胞，再加入已制得的GM-CSF-HER2重组蛋白，经诱导激活制本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种GM?CSF??HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张超，叶永清，苏国新，
申请(专利权)人：上海柯莱逊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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