耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原HI2及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原HI2及制备方法和应用，该重组融合蛋白由金黄色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）与铁表面决定蛋白(IsdB)片段组成，其中，Hla与IsdB片段通过连接肽融合。该蛋白可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。本发明专利技术采用基因工程技术重组表达此融合蛋白，不仅表达量高便于分离纯化而且高效安全。动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，特别涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌alpha溶血素无毒突变体与铁表面决定蛋白(IsdB)活性片段的重组融合重组蛋白HI2，本专利技术进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其在制备疫苗和检测试剂盒中的应用。
技术介绍
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，能导致人体产生广泛的疾病，如菌血症，心内膜炎，毛囊炎，疔，疖，痈，脓疱病，蜂窝(组)织炎，葡萄状菌病，毒性休克综合症 ，中枢系统感染，感染性眼部炎性疾病，骨髓炎，骨及关节感染，呼吸系统感染等，给人类健康带来极大的威胁。而由于该菌的多重抗生素耐药性使得局面更加难以控制，治疗手段的选择越来越少。免疫学手段被寄以厚望用以控制金黄色葡萄球菌尤其耐甲氧西林金黄色葡萄球的感染及传播。免疫策略可以分为主动免疫与被动免疫，被动免疫用靶向金黄色葡萄球菌的抗体进行，主动免疫通过选择合适的抗原促使机体产生免疫反应。合适的多糖及多肽都可以作为抗原构成疫苗的有效组分。Hla是一个在大多数临床分离株上都表达的穿孔形成毒素。它与多种疾病有关如肺炎，败血症关节炎及脑脓疮等。Hla单体约33kDa,以七聚体形式发挥功能,每个单体的第110-150氨基酸互相靠拢在磷脂双分子层上形成孔。随后导致细胞膜破坏，胞内离子渗出等。其毒性很强，在很低浓度情况下即可致病。因此，诱导机体产生高效抗Hla抗体应是控制金黄色葡萄球菌感染的一个重要方面。我们在此专利技术中将突变后无毒的Hla (H35L)作为疫苗的候选组分之一。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA —个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。IsdB蛋白为跨膜蛋白，其胞外区对应15广277氨基酸序列(II)和338 466氨基酸序列(12)两个结构功能域在捕获血红蛋白发挥主要作用。我们在此专利技术中将12作为疫苗的另一候选组分并与Hla (H35L)融合。
技术实现思路
针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本专利技术提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌alpha溶血素无毒突变体与铁表面决定蛋白B活性片段的重组融合重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。本专利技术采用基因工程技术重组表达所述融合蛋白，不仅表达量高便于分离纯化而且高效安全。动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。重组融合蛋白由金黄色葡萄球菌alpha溶血素(Hla)与铁表面决定蛋白B(IsdB)片段(12)组成，其中，Hla与12通过连接肽融合。所述重组融合蛋白具有Hla-Linker_I2的结构特点，简称HI2 ;具有SEQ ID NO:1的DNA序列及SEQ IDNO:2的氨基酸序列。所述连接肽为Linker，该连接肽为-(Linker) n_，其中Linker为GGGGS或GGSGG或 YAPVDV, η 为 1-4，优选 Linker 为 GGGGS, η 为 I。所述Hla为H35L的无毒突变体，其DNA序列如SEQ ID NO: 3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示所述12为金黄色葡萄球菌铁表面决定蛋白B膜外区第二结构域，即第484-559位氨基酸组成的多肽，其DNA序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID Ν0:6所示。上述的重组融合蛋白的制备方法蛋白， 包括以下步骤I)全基因合成(由上海捷瑞生物技术有限公司合成)以获得编码ΗΙ2的DNA序列并克隆到表达载体；2)将所表达载体然后转化至宿主菌，诱导转化后的宿主菌表达ΗΙ2重组蛋白。所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体,优选为pGex_6P_2。表达上述表达载体的宿主菌。所述宿主菌为大肠杆菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XLl-blue。本专利技术优选采用pGEX-6p_2载体构建重组表达载体，表达重组蛋白HI2，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体,其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。如上所述的重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。上述的重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。鉴于Hla有极强的毒性，本专利技术在其活性位点H35进行了突变，用Leu替代，即Hla(H35L)。IsdB分子较大，我们选用具有良好免疫原性的第二个结构域IsdB (338-466)与Hla(H35L)融合，以期达到便于表达纯化，具有更好的免疫原性的效果。本专利技术还提供一种宿主菌，其导入有上述构建的重组表达载体。本专利技术采用基因工程技术克隆表达此重组融合蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。HI2重组蛋白可直接与佐剂(如氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、单硬脂酸铝佐剂、MF59、完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。我们根据金黄色葡萄球菌基因组学及蛋白质组学的最新成果，确定构建基于alpha溶血素(Hla)及铁表面决定蛋白(IsdB)的疫苗。本专利技术的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点I) HI2重组蛋白表达质粒在原核表达系统一大肠杆菌中诱导表达；2)选择pGEX载体系列时，HI2重组蛋白以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性；纯化出来的HI2重组蛋白纯度大于 95% ；3) HI2重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。利用本专利技术HI2重组蛋白制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，所述基因工程重组多价疫苗具有良好的抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时为防治疫苗和诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。为了使本专利技术目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。附图说明图1为表达载体pGEX-6p-2_HI2的酶切鉴定结果·泳道1:核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2 :重组表达质粒pGEX-6p-2_HI2经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段为4. 8kbp 和1. 3kb ；图2HI2蛋白纯化结果泳道1:蛋白分子量标准(Marker)；泳道2 GST-HI2 蛋白泳道3:经PP酶后纯化得到的HI2蛋白，该蛋白理论分子量为47. 7kD，从图看出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组融合蛋白，其特征在于：该蛋白由金黄色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）及铁表面决定蛋白B(IsdB)片段通过连接肽融合而成，该重组融合蛋白的DNA序列如SEQ?ID?NO:1所示，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹全明，樊绍文，卢陆，曾浩，冯强，左钱飞，章金勇，顾江，鲁东水，
申请(专利权)人：重庆原伦生物科技有限公司，中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：