本发明专利技术涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原I1C的制备方法和应用，该融合蛋白由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的一个活性片段I1与ClfA抗原分子的一个活性片段C通过连接肽融合而成。该融合蛋白纯度高，表达量高，便于分离纯化，高效安全，其制备方法简捷、容易放大、重复性好，所述融合蛋白辅以铝佐剂后，可制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，通过动物试验验证，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好抗MRSA感染的免疫保护作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，特别涉及一种用于人的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原IIC及制备方法和应用。
技术介绍
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌指的是对恶唑类青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌，是一种存在人和动物的体表、鼻咽、会阴部及肠道的革兰阳性菌，通常引发皮肤软组织感染、菌血症以及转移并发症，如肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。自1961年被英国学者Jevons首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%。因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，变异性大，且呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”，这一特点使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。在国外，2005年美国的MRSA感染监控资料显示，美国全年的严重感染人数为9.4万多人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。在国内，2010年中国CHINET细菌耐药性检测网结果显示，国内主要地区14所教学医院，MRSA平均检出率为51.7%，最高为77.6% ；2008年中国CHINET细菌耐药性监结果显示，国内主要地区12所教学医院MRSA平均检出率为55.9%，最高为77.5%，属于MRSA感染的严重国家之一。以上海为例，2004年该地区14所医院金黄色葡萄球菌中MRSA的平均检出率为63.9%，最高为86.5%，而2006年MRSA的平均 检出率为64.6%，最高达92.5%。由此可见，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不断攀升，严重威胁人类健康。目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA, IsdB、肠毒素、TSST-U α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA—个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。ClfA是一种调节金葡菌与纤维蛋白素的结合，促进金葡菌同生物材料表面、血块、血小板、内皮表面结合的黏附素。在金葡菌与血小板的结合中ClfA也起着重要的作用，在导管诱导所致金葡菌心内膜炎的动物模型中，其相互作用也很关键。ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。由于ClfA全蛋白具有纤维蛋白结合活性，不适宜做为疫苗候选抗原，本研究利用生物信息技术筛选到不能与纤维蛋白结合的结构域C。同时筛选出IsdB的结构域II。通过理论设计及实践优化，选择到能有效将两者结合起来并使融合蛋白具有良好免疫活性的连接肽。最后形成IlC重组蛋白。目前尚未见使用ClfA、IsdB选择一个亚单位的活性功能片段的融合蛋白作为免疫原性材料，制备MRSA双价疫苗的报道。
技术实现思路
针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性的问题，本专利技术提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组融合蛋白11C，该融合蛋白纯度高，表达量高，便于分离纯化，高效安全。本专利技术所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组融合蛋白11C，由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的一个活性片段(Il)与ClfA抗原分子的一个活性片段(C)组成，活性片段Il与活性片段C通过连接肽融合而成。重组蛋白IIC的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ IDN0:2所示。活性片段Il的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。活性片段C的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。连接肽氨基酸序列结构为-(GGGGS) η-,或-(GGSGG) η-，或(YAPVDV) η-,或-(YVPVDV) η-,所述 η 为 I。所述连接肽氨基酸序列结构优选-YVPVDV-。上述重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤:I)全基因合成编码IlC的DNA序列，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成；2)所合成的目的基因片段克隆至表达载体，然后转化至宿主菌；表达载体为pGex系列载体，或pET系列载体，或pQE系列载体，优选为pGeX-6P_2。宿主菌为大肠杆菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XLl-blue。3)诱导转化后的宿主菌表达IlC重组蛋白。本专利技术优选采用pGEX-6p_2载体来构建重组表达载体，表达重组蛋白IlC，pGEX是由Smith和Johnson于1987年构建的表达融合蛋白的载体,其主要特点是载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签是蛋白纯化的标记。与其他融合载体相比，PGEX系列载体具有纯化条件温和、步骤简单、不需要变性剂的加入，从而使纯化后的蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性。上述重组融合蛋白的分子量、N末端及C末端15个氨基酸检测由上海中科新生命生物科技有限公司完成。检测 结果:分子量为34909.6，符合理论预期(附图2) ;N末端及C末端氨基酸序列与理论预期完全一致。本专利技术还提供一种重组蛋白IlC在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。本专利技术还提供一种重组蛋白IlC在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。本专利技术采用基因工程技术克隆表达此截短的保护性抗原成分IlC蛋白，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。该重组蛋白Iic可以直接与佐剂(如Al (OH)3佐剂、MF59、A1P04、A1S03、A1S04、不完全弗氏佐齐[J、完全弗氏佐齐[J、分枝杆菌卡介苗佐剂等)配合使用，适用于注射免疫接种。本专利技术的基因工程重组蛋白的表达方法具有以下优点:I)重组蛋白表IlC达质粒在原核表达系统一大肠杆菌中诱导表达；2)选择pGEX载体系列时,重组蛋白IlC以融合蛋白形式表达；表达载体上接有一个分子量为26kDa的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，所表达的融合蛋白中就含有一个GST标签，此标签就成为蛋白纯化的标记，使得纯化条件温和、步本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组融合蛋白I1C，其特征在于：该融合蛋白由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的一个活性片段I1与ClfA抗原分子的一个活性片段C通过连接肽融合而成。
【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白11C,其特征在于:该融合蛋白由MRSA铁尚子表面决定蛋白IsdB的一个活性片段Il与ClfA抗原分子的一个活性片段C通过连接肽融合而成。2.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，核酸序列如SEQ ID NO: 2所示。3.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，所述活性片段Il的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。4.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，所述ClfA抗原分子活性片段C的核酸序列如SEQ I D NO:5所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。5.根据权利要求1所述的重组蛋白I1C，其特征在于，所述连接肽氨基酸序列结构为-(GGGGS) n-，或-(GGSGG) η-,或(YAPVDV) η_，或-(YVPVDV) η-,所述 η 为 I。6.根据权利要求5所述的重组蛋白I1C，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹全明，樊绍文，曾浩，冯强，吴翼，蔡昌芝，郭鹰，
申请(专利权)人：重庆原伦生物科技有限公司，中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：
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