本发明专利技术涉及一种胃癌靶向重组毒素及其制备方法，属于靶向重组毒素及其制备方法。利用人胃泌素G17与绿脓杆菌外毒素A衍生的重组毒素PE38KDEL连接形成的具有胃癌靶向的重组毒素，特别是利用原核表达系统表达的反向翻译的G17作为导向单元，通过基因工程表达制备该重组毒素；并建立其独特的规模化生产可溶性蛋白的发酵条件，提供了一种靶向胃癌的具有高度选择杀伤活性重组毒素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是利用基因工程制备胃癌靶向重组毒素。
技术介绍
胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，是中国的第二大常见肿瘤。手术是目前唯一根治胃癌的方法，但只有不足1/3的人能够进行手术治疗，对于中晚期病人除进行手术治疗外常配合化疗、放疗等治疗手段；但化疗和放疗副作用太大，往往严重破坏患者的免疫系统。40年前，Moolten FL等提出的免疫毒素概念为癌症的治疗带来一片光明；免疫毒素的策略是利用抗原-抗体、细胞因子-受体的特异性结合，基于肿瘤细胞表面的特殊标志物或特异的受体或与正常细胞受体数量的巨大差异，以其作为靶向使毒素集中于肿瘤细胞周围，最终将肿瘤细胞杀死而对正常细胞无损害。目前许多重组毒素已进入临床试验。美国已有I种药物(DT-1L2，0NTAK)上市，另有15种进入I期以上的临床试验，国内朱平领导的研究小组研制的LHRH-PE40重组毒素正在进行II期临床试验。在血液肿瘤方面，Ant1-Tac(scFv)-PE38 (LMB-2)可靶向杀伤 CD25 (IL-2R)阳性细胞，在临床I期试验中对35例的白血病淋巴瘤、霍奇金病患者使用，I例完全缓解，7例部分缓解；RFB4(dsFv)PE38 (BL22)可靶向杀伤⑶22阳性的淋巴瘤细胞，16例白血病患者中 11 例完全缓解，2 例部分缓解；IL6(23)-PE40KDEL 和 IL6 (D24)-linker_PE40KDEL 是两种新型重组毒素，可选择性杀伤高表达IL-6受体的白血病细胞；抗0064分子的单链抗体片段(m22)与ETA融合形成m22(SCFv)-ETA’可特异性杀伤表达CD64的急性髓性白血病母细胞；TH69与PE融合形成的重组毒素能够诱导⑶7阳性的白血病T淋巴细胞凋亡。在实体瘤方面，B3 (scFv) -PE38 (LMB-7)、B3 (dsFv) -PE38 (LMB-9)能识别表达 LeY 抗原的乳腺癌、肺癌、结肠癌等肿瘤细胞；e23(dsFv)-PE38(Erb38)、e23(scFv)-PE38KDEL (AR209)都是针对在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌中过量表达的Erb-B2的重组毒素；TGFa -PE40的衍生物TGF a -PE40-8cys目前已经用于膀胱癌的临床I期试验；IGF-1_PE40靶向癌细胞表面的胰岛素样生长因子(IGF-1)，能杀伤乳腺癌细胞、肝癌细胞；IL13-PE38QQR已进入临床试验，适应症为肾癌。作为活性单元的毒素分子,最常用的为白喉毒素(Diphtheria Toxin, DT)、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin, PE),然而由于成人体内大都预存有DT的抗体，因此DT的应用受到一定限制。PE的高毒性及细胞杀伤机制已得到详细阐述，是制备免疫毒素的一种理想毒素分子:PE是分子量为66kDa的单链蛋白，由613个氨基酸残基组成。PE分三个功能区，即 Domain I>Domain II 和 Domain III, Domain I 由 Ia 和 Ib 组成，Ia 区(l_252aa)是受体结合区，引导PE与靶细胞膜上的受体识别并结合；11区(253-364aa)是跨膜转位区，它由7个α螺旋组成；111区(400_613aa)是酶活性区，具有ADP-核糖基化的酶学活性。PE通过以下步骤 杀伤细胞:㈠G17取代Ia区与CCK-BR或AnnexinII结合将重组毒素聚集到靶细胞表面，II区使其内化进入细胞内；㈡内化后的PE38KDEL在第279-280位氨基酸处被哺乳动物细胞内的Furin蛋白酶裂解，游离出37kDa的片段；曰维系毒素结构的位于第265位和第287位半胱氨酸之间的二硫键被还原；㈣第280-313位氨基酸对毒素在胞液中的转位起调节作用，毒素转运至内质网并转运到胞液中，毒素羧基端KDEL结合至胞内选择性受体上，第400-602位氨基酸发挥ADP核糖基化活性，使eEF_2失活，阻止肽链延伸而抑制蛋白质的合成。PE还可以通过其他途径诱导细胞凋亡，当阻断PE对eEF-2的作用后，PE融合毒素仍表现出较强的诱导靶细胞凋亡的功能。PE毒素分子被修饰和改造出现了几种衍生物，主要是缺失Ia区使其失去细胞结合能力，同时使用KDEL序列替换REDLKJI加其内质网亲和性，其细胞毒性增加6倍以上，目前最常用结构有PE40KDEL和PE38KDEL，目的在于减少其分子量、增加细胞毒性、增加分子穿透力和降低体内免疫学反应的副作用。利用反向翻译的胃泌素17肽作为导向单元，主要根据CCK-BR在胃癌细胞中过表达，表达程度还与肿瘤的浸润深度、淋巴结及静脉侵犯、是否有肝转移有关这一事实；CCK-BR阳性的肿瘤患者预后较差，提示CCK-BR与胃癌的进展有关。临床上100%的胰腺导管细胞癌有CCK-BR表达，85.0%的导管内乳头状胰腺癌及65.8%的浸润性导管胰腺癌表达CCK-BR，胆管癌CCK-BR阳性率为82.5%，而正常胰腺不表达或微弱表达；肿瘤呈浸润性生长时比膨胀性生长时表达更多的CCK-BR，纤维化程度越重CCK-BR的表达越高。64%的胆囊腺癌有CCK-BR表达，94%的乳头状胆囊腺癌表达CCK-BR。CCK-BR主要存在于胃壁细胞上，调节胃酸分泌，对胃泌素和CCK的亲和力相似。对胃癌及临近粘膜表达胃泌素受体差异的研究显示，胃癌较周围粘膜易于表达高含量的胃泌素受体，其表达量与肿瘤的部位和分期相关，胃泌素受体在晚期胃癌中高表达。胃癌细胞以表达高亲和力受体为主，含量达(39.54±14.43) fmol/mg蛋白，而周围和正常细胞以表达低亲和力受体为主，含量为(6.03±2.83) fmol/mg 蛋白。总之，作为导向的结合 单元，其受体在肿瘤细胞与正常细胞上表达数量的差别是其准确杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞的关键因素。Watson SA证实每个MKN45细胞含有3X IO3个CCK-BR，正常胃细胞上的CCK-BR受体数极少，胃癌及胰腺癌细胞高表达。
技术实现思路
本专利技术涉及，目的是提供一种靶向胃癌的具有高度选择杀伤活性重组毒素及其制备方法。本专利技术采取的技术方案是:胃癌靶向重组毒素的氨基酸序列是SEQ N0.1。本专利技术所述胃癌靶向重组毒素的制备方法包括下列步骤: 根据表达宿主密码子的偏爱性，优化基因并进行人工合成，将该基因进行Xba I与EcoRI双酶切，插入pET_28a载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),得到重组菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)，该重组菌株经异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，目的蛋白获得高效表达。本专利技术所述基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所述。本专利技术所述诱导条件是:S0B培养基，1%接种量接种，160rpm 37°C摇培2h后加入终浓度为1.0 mM的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG，180rpm 30°C继续4.5h。本专利技术胃癌靶向重组毒素的制备方法中还包括蛋白纯化方法: 对所获得的目的蛋白，超声300W破碎5min，离心取上清；45%的硫酸铵沉淀后，0.4M硫酸铵、20mM Tris、pH7.4的缓冲液重悬，过滤后进行Phenyl FF线性纯化；目标蛋白峰收集液上DEAE S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胃癌靶向重组毒素，其特征在于胃癌靶向重组毒素的氨基酸序列是SEQ?No.1。
【技术特征摘要】
1.种胃癌靶向重组毒素，其特征在于胃癌靶向重组毒素的氨基酸序列是SEQ N0.1。2.权利要求1所述的一种胃癌靶向重组毒素的制备方法，其特征在于包括下列步骤: 根据表达宿主密码子的偏爱性，优化基因并进行人工合成，将该基因进行Xba I与EcoRI双酶切，插入pET_28a载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),得到重组菌株Rosetta(DE3)(pET-rG17PE38)，该重组菌株经异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，目的蛋白获得高效表达。3.权利要求2所述的一种胃癌靶向重组毒素的制备方法，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ N0.2所述。4.权利要求2所述的一种胃癌靶向重组毒素的制备方法，其特征在于所述诱导条件是:SOB培养基，1...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳增善，宋杰，任洪林，卢士英，李岩松，周玉，张茂林，高世奇，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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