胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物制备方法及应用技术

本研究以疫苗接种所产生的特异性细胞免疫和单克隆抗体的免疫导向作用为理论依据，将卡介苗(BCG)的有效成分胞壁酰二肽(MDP)与抗淋巴瘤细胞膜抗原CD20的单克隆抗体Rituximab结合制备成胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物，即MDP-Rituximab，了解经BCG免疫后的免疫活性细胞，在MDP-Rituximab的介导下的体内外抗肿瘤效果。该偶联物保持了MDP的免疫原性，刺激机体产生特异性的T细胞免疫应答，借助Rituximab抗体与淋巴瘤细胞膜CD20分子结合的免疫导向作用，将MDP带到残留的淋巴瘤细胞周围，通过MDP诱导T细胞介导的免疫应答达到清除残存肿瘤的最终目的，这样该方法不仅克服了单用Rituximab药物抗性，而且减少了抗体用量，预示其在恶性淋巴瘤中的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物制备方法及应用
：本专利技术涉及一种具有靶向结合抗原且具有通过刺激免疫活性细胞发挥抗肿瘤作用的胞壁酰二肽-抗CD20免疫偶联物(MDP-Rituximab)，本专利技术公开了其制备方法，及其在淋巴瘤治疗的作用。
技术介绍
：据世界卫生组织统计，淋巴瘤发病率每年增长7.5％，是目前发病率增长最快的恶心肿瘤之一。我国淋巴瘤的发病率大约为2/10万人口，每年新发病例2.5万人，死亡2万人，儿童占全国人口的30％，因此，每年大约有近万新例新发患儿。其死亡率占儿童恶性肿瘤的首位。提高儿童淋巴瘤的诊治水平是广大血液工作者急需解决的问题。90％以上为B细胞淋巴瘤中均有CD20表达，就目前国内外的治疗状况，儿童恶性淋巴瘤(NHL)的治疗首选仍以联合化疗为主，其治疗效果主要取决于治疗反应。尽管儿童恶性淋巴瘤是可治愈性疾病，但是仍有大约50％以上的NHL患儿发生耐药，导致治疗无效或复发。因此，完全缓解后抗复发治疗或停药后清除耐药肿瘤细胞是治疗NHL急需解决的问题。采用单克隆抗体(MAb)的治疗方法具有有效治疗肿瘤的潜力，且已被用于某些肿瘤的治疗。Maloney等首次将抗CD20抗体(Rituximab，美罗华)单独应用于I期临床试验治疗复发或低度恶性的B细胞淋巴瘤，1997年美国食品药物管理局(FDA)和1998年在欧洲批准美罗华用于CD20阳性的复发性或难治性低度恶性或滤泡性B细胞NHL。(MaloneyDG，LilesTM，CzerwinskiDK，WaldichukC，RosenbergJ，Grillo-LopezA，LevyR.PhaseIclinicaltrialusingescalatingsingle-doseinfusionofchimericanti-CD20monoclonalantibody(IDEC-C2B8)inpatientswithrecurrentB-celllymphoma.Blood1994；1584(8)：2457-66.MarcusR，HagenbeekA.ThetherapeuticuseofRituximabinnon-Hodgkin’slymphoma.EurJHaematolSuppl.2007；(67)：5-14)。B细胞NHL表达的膜抗原有CD19、CD20、CD22、CD33、CD37、CD52等，其中CD20抗原的表达率达90％以上。CD20是非糖基化的III型跨膜蛋白，分子量35KD具有高度的保守性，人与鼠的CD20同源性可达73％，其功能类似于钙离子通道，参与调解B淋巴细胞的生长与分化，是常用于诊断B细胞淋巴瘤的一种指标。抗体导向治疗具有高效、低毒和靶向性等特点，在恶性血液疾病的治疗中越来越受到关注，Rituximab(美罗华)是第一个被FDA批准用于治疗肿瘤的单克隆抗体，该抗体为人鼠嵌合型IgG抗体。能特异性识别表达CD20的恶性B淋巴细胞和正常成熟B淋巴细胞，对其它正常细胞并无杀伤作用，因此由最早用于治疗复发及难治性B细胞淋巴瘤，逐渐作为一线药物用于治疗分化差的淋巴瘤和淋巴细胞白血病。其主要通过诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、诱导补体介导的溶细胞作用(CDC)、诱导细胞凋亡等机制发挥抗肿瘤作用，目前Rituximab已治疗了30多万例病人，单药治疗总反应率约50％，联合化疗有效率高达80％以上。尽管Rituximab治疗B细胞淋巴瘤有明显的疗效，但经过长期治疗后发现，约半数以上病人产生耐药，耐药出现的原因除了肿瘤细胞自身产生耐药性外，还可能存在肿瘤细胞周围免疫环境改变等因素(RezvaniAR，MaloneyDG.Rituximabresistance.BestPractResClinHaematol.2011；24(2)：203-16.)，其中可能涉及：(1)肿瘤本身细胞中CD20抗原分子减少、集体的FcγRIII受体基因效应细胞的多态性(CartronG，DacheuxL，SallesG，Solal-CelignyP，BardosP，ColombatP，WatierH.Therapeuticactivityofhumanizedanti-CD20monoclonalantibodyandpolymorphisminIgGFcreceptorFcgammaRIIIagene.Blood.2002；99(3)：754-8)；(2)ADCC作用的效应细胞耗竭：Rituximab通过其Fc段招募效应细胞集介导ADCC效应，其中主要起作用的是NK细胞，目前研究显示Rituximab的ADCC作用主要限制因素是NK细胞的耗竭(BhatR，WatzlC.Serialkillingoftumorcellsbyhumannaturalkillercells-enhancementbytherapeuticantibodies.PLoSOne.2007；2(3)：e326)；(3)有关补体调节蛋白异常；(4)抗细胞凋亡基因表达增强有关：Rituximab可与CD20交叉偶联促进caspases的激活而引起B细胞系死亡，但Bcl-2的过表达倾向于阻碍单抗导致的细胞死亡。虽然CD20单抗在治疗上还存在这些局限性，且单独应用Rituximab治疗肿瘤的抗体需要量极大，生产价格非常昂贵，半衰期较短决定需反复用药，会增加了患者及其家庭痛苦，但它的高度特异性与低免疫源性决定了其在肿瘤生物靶向治疗中的重要地位，并且随着深入的临床研究，结果表明其在自身免疫疾病的治疗中也发挥着重要作用，因此，目前越来越多的学者致力于探索完善其效能的方法，目前倾向于通过蛋白重组构建结合型抗体(如抗CD20与抗CD22抗体的重组)(GuptaP，GoldenbergDM，RossiEA，ChangCH.Multiplesignalingpathwaysinducedbyhexavalent，monospecific，anti-CD20andhexavalent，bispecific，anti-CD20/CD22humanizedantibodiescorrelatewithenhancedtoxicitytoB-celllymphomasandleukemias.Blood.2010；116(17)：3258-67.)及通过将放免制剂与抗体偶联而增强疗效(如131I/90Y-Rituximab)(IllidgeT，MorschhauserF.Radioimmunotherapyinfollicularlymphoma.BestPractResClinHaematol.2011；24(2)：279-93.)。抗肿瘤免疫主要以细胞免疫为主。由于肿瘤细胞缺乏特异性抗原或因特异性抗原的免疫源性差，因此肿瘤的非特异性免疫治疗被广泛地应用于临床。同时，淋巴瘤患儿随着化疗时间的延长，机体的免疫功能进一步损伤，难以识别或清除残留的肿瘤细胞。因此对长期完全缓解的患儿提高机体的免疫功能是争取治愈的关键。国内外已有大量研究BRM如卡介苗(BCG)(LudwigAT，MooreJM，LuoY，etal.Tumornecrosisfactor-relatedapoptos本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胞壁酰二肽(MDP)?抗CD20(Rituximab)免疫偶联物，其特征在于其为式I所示的化合物或其盐，其中为抗CD20单克隆抗体，n3为1、2、3、4、或5，n4为0、1、2、3、4、或5，n1为1、2、3、4、5或6。式I。FSA00000743676900011.tif,FSA00000743676900012.tif

【技术特征摘要】
1.一种胞壁酰二肽MDP-抗CD20Rituximab免疫偶联物的制备方法，其特征在于免疫偶联物为式I所示的化合物或其盐，其中为抗CD20单克隆抗体，n3为3，n4为2，n1为3；制备方法如下：化合物1的制备氩气保护下，在烧瓶中，加入Boc保护的连接臂N-Boc-1，3-丙二胺盐酸盐20mg，用3ml二甲基甲酰胺溶解，加入过量的三乙胺，然后加入N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶硫基)丙酸酯，室温搅拌反应1h，点板检测反应结束，后经过硅胶柱分离，真空蒸干，得产物化合物1；化合物2的制备氩气保护下，在反应瓶中，加入化合物110mg，加入1.5ml二氯甲烷，冰浴下搅拌10min，缓慢加入1.5ml三氟乙酸，冰浴条件下搅拌反应20min，点板检测反应结束，减压浓缩蒸干，并加入适量纯甲醇，再次蒸干，得到化合物2；化合物3的制备氩气保护下，在10ml反应瓶中，加入胞壁酰二肽5mg、化合物23mg，用2ml二甲基甲酰胺和四氢呋喃溶解，冰浴条件下加入1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙立荣，王玲珍，
申请(专利权)人：孙立荣，王玲珍，
类型：发明
国别省市：