抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体及其制备方法技术

抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该双特异性单克隆抗体对氯霉素和安普霉素同时具有特异性。该双特异性单克隆抗体制备方法如下：合成氯霉素和安普霉素的半抗原和人工抗原；利用氯霉素人工抗原制备分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株；利用安普霉素人工抗原制备分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株；抗氯霉素的杂交瘤细胞株和抗安普霉素的杂交瘤细胞株细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体。本发明专利技术得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，并用这个抗体建立了ELISA分析方法，为氯霉素和安普霉素的快速检测提供技术基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及和应用。
技术介绍
免疫分析方法(Immunoassay，IA)是一种以抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的一门技术，是基于抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应，具有特异性强、灵敏度高、方便快速、高通量、检测成本低、安全可靠等特点。该方法一般不需要贵重仪器，使用人员技术要求不高，容易普及和推广，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。免疫分析法起始于20世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，创立了放射免疫分析技术。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、酶标记、荧光标记、金标记、化学发光等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物既保持了抗体或抗原的活性，也不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析技术的敏感性。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。目前采用免疫分析方法进行多残留检测常有两种方法，一种是采用一类药物的共有结构作为免疫半抗原，获得对同类农药具有特异性识别反应的广谱抗体，如Alococer等用有机磷的通用结构膦酸作为半抗原，成功制备了广谱性的多克隆抗体，且对10种以上的有机磷农药有特异性识别；骆爱兰等用拟除虫菊酯类农药的共有结构间苯氧基苯甲酸(PBA)为半抗原，也成功制备了广谱性的多克隆抗体，并对5种菊酯有特异性识别。另一种是采用将多个农药的半抗原偶联到载体蛋白上制备成人工抗原，经过动物免疫获得对目标农药有特异性识别的“宽谱特 异性抗体(broad specificity antibody)”,如王姝婦等通过对人工抗原的设计，将克百威、三唑磷、毒死蜱和甲基对硫磷半抗原偶联到一个载体蛋白分子上制备出了多抗原决定簇的人工抗原并获得了能同时识别上述四种农药的“宽谱特异性”多克隆抗体，达到多残留检测的目的。抗体在多残留免疫分析中的作用非常关键，抗体质量的好坏直接影响免疫分析的准确性和灵敏度，因此获得好的抗体是多残留免疫分析技术的首要工作，已报道的药物多残留免疫检测的抗体均为多克隆抗体，由于多克隆抗体会随着动物种类及个体差异而有变化，生产数量上也会受到一定的限制，制备的抗体可重复性差，在应用中会受到一定的限制，随着单克隆抗体技术的出现，解决了抗体制备过程中抗体性状不稳定的问题，并且单克隆抗体技术获得的杂交瘤细胞在体外能无限量分泌性状稳定的抗体，因此，在小分子药物免疫分析中单克隆抗体已逐渐取代多克隆抗体。传统的免疫快速诊断技术中使用的抗体不论是多克隆抗体还是普通单克隆抗体，一个抗体分子均只识别一种或者一类抗原，使检测范围受到很大的限制，随着单克隆杂交瘤技术的发展和不断完善，Milstein等首次报道了一株能分泌双特异性单克隆抗体(Bispecific Monoclonal Antibodies, BisMcAb)的杂交-杂交瘤(Hybrid Hybridomas)细胞，标志着双特异性单克隆抗体技术的创立。双特异性单克隆抗体是结构上双价，功能上单价的免疫球蛋白分子。其基本结构中两个Fab端的结构和功能不相同，能分别结合两种不同抗原。由于双特异性单克隆抗体在结构上的特殊性，具有两个不同的抗原识别位点，如果能把该抗体技术引入到药物残留快速诊断技术中来，特别是在面临多残留快速检测技术需求的背景下，在一定程度上能满足多残留检测所面临的新的要求，该技术从抗体的结构和特性上入手，区别于传统的多残留免疫分析技术在半抗原和人工抗原的结构上进行一系列的改造，通过杂交-杂交瘤技术获得能特异性识别两种同类药物甚至是结构差异大得两类药物的双特异性单克隆抗体，与传统的抗体快速检测相比具有质的飞跃，为探索药物多残留快速检测技术新的研究领域和发展方向方面具有重要意义。氯霉素(chloramphenicol, CAP)是一种广谱抗生素,对革兰氏阳性、阴性细菌均有抑制作用，是治疗伤寒、副伤寒和沙门氏病的首选药物，对乳房炎也有很好的疗效，广泛应用于动物各种传染性疾病的治疗，造成在`动物组织的残留。其毒副作用表现为抑制骨髓造血功能，引起人类的早产儿灰色综合症，再生障碍性贫血等，因此动物组织中氯霉素的残留对人类健康产生严重的威胁。许多国家严禁将氯霉素用于食品动物(特别是鸡蛋和奶牛)，并规定氯霉素的MRL为0-0.01mg/kgo我国和美国均规定在动物性食品中不得检出氯霉素(含量在Ing/mL以下)。欧盟不允许氯霉素用于产奶母牛和产蛋鸡，严格规定肉中的氯霉素残留量不得检出，所以发展适宜的方法以快速、灵敏的检测动物组织中的氯霉素残留就显得非常重要。目前，氯霉素残留分析方法主要有微生物检测法、理化检测法和免疫检测法等。微生物法虽然普遍适用于抗菌药物的残留检测，它易受组织中其他抗生素的影响，特异性低，灵敏度也不高，但操作简便，样品用量少，预处理简单，在基层大规模筛选工作中有很大的应用价值。理化检测法虽然结果准确，但检测设备昂贵，需专业人员操作，样品前处理方法烦琐，不适于批量样品的筛选检测任务，因此，开发一种简单、快速，适于现场监控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的现实意义。安普霉素(Apramycin, Apra)又名暗霉素、阿泊拉霉素、阿布拉霉素,是氨基糖苷类抗生素的典型代表药物。安普霉素是美国礼来公司于1985年开发的新产品，目前我国也可生产，它是由黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)突变株发酵产生的。饲料中使用的多为安普霉素的硫酸盐(Apramycin sulphate),其为棕褐色结晶粉末或暗淡的黄色粉末，极性强，易溶于水，微溶于乙醇。氨基糖苷类抗生素使用不当，会对动物的肾脏及听觉产生毒副作用。因此，国内外相继规定了氨基糖苷类抗生素在动物食品中的最高残留限量。1996年欧盟确定了庆大霉素、新霉素、链霉素和双氧链霉素在奶和组织中的最闻残留限量为100-5000ng/ml。2000年欧盟规定，链霉素和双氢链霉素在牛奶中的最高残留限量是200ng/ml，在肌肉、肝脏、脂肪组织中是500ng/ml，在肾脏中则不能超过1000ng/ml。我国农业部于2002年12月14日235号公告发布的《动本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的双特异性单克隆抗体对氯霉素和安普霉素同时具有特异性。

【技术特征摘要】
1.氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的双特异性单克隆抗体对氯霉素和安普霉素同时具有特异性。2.氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)合成氯霉素和安普霉素的半抗原和人工抗原； 2)利用氯霉素人工抗原制备分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞株； 3)利用安普霉素人 工抗原制备分泌抗安普霉素的杂交瘤细胞株； 4)抗氯霉素的杂交瘤细胞株和抗安普霉素的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体。3.按权利要求2所述的抗氯霉素和安普霉素的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中分泌抗氯霉素的杂交瘤细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：金仁耀，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：