一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体，所述抗体按如下方法制备：基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列，合成蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域多肽；将多肽与载体偶联、缀合或融合，制备抗原肽复合物；将抗原肽复合物注入母鸡体内进行免疫，连续收集鸡蛋；从收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体，即获得所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体；本发明专利技术所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体产率高、成本低；所得到的抗体安全性高、稳定性好、过敏性不良反应小；可以做成口服制剂或注射剂；可用于具有血循毒性蛇毒咬伤治疗，尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬伤治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种血循型蛇毒鸡卵黄抗体(Immunoglobulin-yolk, IgY)及制备方法与应用。具体而言，是基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性基序多肽免疫，制备抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法。
技术介绍
长久以来，毒蛇咬伤给人们的生产生活带来了严重危害，据世界卫生组织网站公布的数字显示:全世界每年被蛇咬伤的人数有250多万人，导致死亡人数高达12.5万人。我国每年毒蛇咬伤患者达10多万人次，其中约73 %为中青年，死亡率为5 % 10 %，蛇伤致残丧失劳动能力者占25% 30% 。可见毒蛇是危害人类健康的一个重要生物安全隐患，必须采取相关措施，降低或消除相关风险。注射抗蛇毒血清是目前世界公认的最有效的治疗方法，但蛇毒本身成分复杂，含有数百种功能各异的蛋白质，用全毒免疫产生的抗蛇毒血清不仅含有能中和毒素成分的抗体，也含有大量针对蛇毒中其他非毒素成分的抗体。这不仅使得抗血清的临床使用剂量大大增加，增加了过敏反应概率，也浪费了宝贵的血清资源(Wagstaff S C，Laing GDj Theakston R Dj et al.Bioinformatics and multiepitope DNA immunization todesign rational snake antivenom.PLoS Medj 2006，3:184.)。如果能够将蛇毒中的主要毒性致死成分分离、纯化，制备单克隆抗体，则其中和相应蛇毒蛋白能力将极大提高，抗体用量减少，不良反应也可相应减少，而且其抗体生产成本也将极大降低，质量也可得到稳定控制。检索相关文献，已有不少有关蛇毒蛋白单克隆抗体的成功制备(尹惠琼.利用噬菌体展示文库技术制备抗蛇毒ScFv抗体.云南大学，2004硕士论文.；李丽红等.眼镜王蛇毒单克隆抗体的制备.细胞与分子免疫学杂志，2009，25 (3): 236-238.等)但绝大部分仅局限于毒蛇分类鉴定和基础理论研究上；这极可能是由于蛇毒毒性成分的多样性(贾艳等.蛇毒的毒性成分及其应用研究.蛇志，2004，16(2):23-32.)，因此至今几乎没有一种单克隆抗体能够完全中和某种蛇毒毒性。尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)是我国常见的毒蛇，属于蝰科蝮亚科，又名五步蛇(浙江)，棋盘蛇(福建)，百步蛇(台湾)，主要栖息于越南北部，老挝和中国南部地区，其毒液主要为血循毒(Li QB, Yu QS, Huang Gff, et al.Hemostaticdisturbances observed in patients with snakebite in south China.Toxicon.2000，38 (10): 1355-1366.Chen CCj Yang CM，Hu FR，et al.Penetrating ocular injurycaused by venomous snakebite.Am.J.0phthalmol.2005，140(3): 44- 546.)。患者被咬伤后，伤口局部红肿、疼痛剧烈，流血不止，肿胀迅速，毒素向肢体上端蔓延，常有水泡、淤斑出现。中毒严重者还会出现血压下降、心律失常、少尿、无尿，最后因循环衰竭而导致死亡。研究表明，蛇毒金属蛋白酶(Wagstaff S C，Laing G Dj Theakston R Dj etal.Bioinformatics and multiepitope DNA immunization to design rational snakeantivenom.PLoS Med，2006，3:184)是引起出血、致死等症状的主要物质，它们有的干扰伤口血液的凝结和血检的形成，有的则降解胞外基质或基底I旲，可占总蛇毒蛋白的60%以上，是蛇毒蛋白中的主要成分；能够有效中和这些金属蛋白酶，则基本可以有效缓解五步蛇毒对机体的损伤。研究表明，蛇毒金属蛋酶和哺乳动物基质金属蛋白酶一样，它们都是金属锌蛋白，有一个锌结合域HEXXHXXGXXH。自1950年以来，已有150多种蛋白酶(其中有100多种毒金属蛋白酶)从蛇毒中纯化出来，其中有超过40种(20多种是金属蛋白酶)的氨基酸全序列被测定。根据已报道的蛇毒金属蛋白酶的cDNA序列和蛋白质的结构，将蛇毒金属蛋白酶分成4类:其中PI类仅含金属蛋白酶域(metalloproteinase domain),分子量20 30kDa ;PII类含金属蛋白酶·域和去整合素域(disintegrin domain),分子量30 50kDa ；PIII类含金属蛋白酶域、去整合素域和富半胱氨酸域(cysteine-rich domain),分子量50 80kDa ;PIV类在PIII类基础上多了二硫键连接的类C型凝集素域(C_typelectin domain) (Cynthia Tallant, Aniebrys Marrero, F.Xavier Gomis-Riith.Matrixmetalloproteinases: Fold and function of their catalytic domains.Biochimica etBiophysica Acta, 2010, 1803:20-28)。金属蛋白酶域是四类蛇毒金属酶类的共有部分。对比分析各蛇毒金属蛋白酶域结果表明，HEXXHXXGXXH序列是酶活性中心的高度保守序列。为此，理论上而言，将该保守序列作为抗原肽免疫动物可以得到针对该类抗原位点的特异性抗血清，而该抗血清极可能均能够与上述各类蛇毒金属蛋白发生交叉反应，起到中和蛇毒毒性作用。而由于免疫动物所用抗原肽的单一性，其制备所得抗血清抗体成分相对单一，可减少抗血清用量，减少不良反应；同时，基于这一抗原肽，可以进一步筛选建立有效的单克隆抗体制剂。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列作为抗原肽，免疫母鸡制备抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体的制备方法；该方法抗体产率高、成本低；所得到的抗体安全性高、稳定性好、过敏性不良反应小；可以做成口服制剂和注射剂；可用于具有血循毒性蛇毒咬伤治疗，尤其适用于五步蛇和短尾蝮蛇咬伤治疗。本专利技术采用的技术方案是:本专利技术提供一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体，所述抗体按如下方法制备:(I)基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列，合成蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域多肽；所述多肽的氨基酸序列为CXnHEXXHXXGXXHXn*XnHEXXHXXGXXHXnC，其中X为除半胱氨酸以外的任何氨基酸，η是包括零的任何正整数；(2)将步骤(I)中的多肽与载体偶联、缀合或融合，制备抗原肽复合物；(3)母鸡免疫:将步骤(2)中的抗原肽复合物注入母鸡体内进行免疫，连续收集鸡蛋;(4)从步骤(3)收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体，即获得所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体。进一步，优选所述η是(Γ20之间的任何正整数。进一步，所述载体包括蛋白或脂类。更优选所述载体为:钥孔血蓝蛋白(keyholeLimpet Hemocyanin)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin)、牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin)、牛甲状腺球蛋白(Bo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体，其特征在于所述抗体按如下方法制备：（1）基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列，合成蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域多肽；所述多肽的氨基酸序列为CXnHEXXHXXGXXHXn或XnHEXXHXXGXXHXnC，其中X为除半胱氨酸以外的任何氨基酸，n是包括零的任何正整数；（2）将步骤（1）中的多肽与载体偶联、缀合或融合，制备抗原肽复合物；（3）母鸡免疫：将步骤（2）中的抗原肽复合物注入母鸡体内进行免疫，连续收集鸡蛋；（4）从步骤（3）收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体，即获得所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体。

【技术特征摘要】
1.种抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体，其特征在于所述抗体按如下方法制备: (1)基于血循型蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域序列，合成蛇毒锌离子金属蛋白酶活性结构域多肽；所述多肽的氨基酸序列为CXnHEXXHXXGXXHXn*XnHEXXHXXGXXHXnC，其中X为除半胱氨酸以外的任何氨基酸，η是包括零的任何正整数； (2)将步骤(1)中的多肽与载体偶联、缀合或融合，制备抗原肽复合物； (3)母鸡免疫:将步骤(2)中的抗原肽复合物注入母鸡体内进行免疫，连续收集鸡蛋； (4)从步骤(3)收集的鸡蛋中提取抗蛇毒鸡卵黄抗体，即获得所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体。2.权利要求1所述抗血循型蛇毒鸡卵黄抗体，其特征在于所述η是(Γ20之间的任何正整数。...

【专利技术属性】
技术研发人员：范永升，蒋福升，丁志山，刘翔宇，吕迪，潘平，毛建洋，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：