猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法技术

本发明专利技术提供了一种依据家蚕反应系统优化的猪IFNγ-Fc融合蛋白及其编码基因和利用家蚕生物反应器表达猪IFNγ-Fc融合蛋白的方法，属于生物基因工程领域。猪干扰素γ作为一种非特异性广谱抗病毒生物制剂在兽药领域具有广阔的药用前景，但是与大多基因工程兽药一样，猪干扰素γ也存在着产量不足、价格昂贵、质量参差不齐、作用时间较短等问题。本发明专利技术利用家蚕表达体系对优化后的猪IFNγ-Fc融合蛋白基因进行表达，得到了表达效率较高活性较强的目的蛋白。此外，Fc片段的添加延长了猪干扰素γ的作用时间，增强了整体免疫调节作用，且便于后期纯化，从而使采用基因工程方法大规模生产猪IFNγ-Fc融合蛋白制剂成为可能，也为开发含有该融合蛋白的新型饲料创造了条件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程和生物工程技术，尤其是涉及一种猪IFNY-Fc融合蛋白及其编码基因和利用家蚕生物反应器表达猪IFNy-Fc融合蛋白的方法。
技术介绍
干扰素(Interferon, IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、Y三种。其中干扰素-Y (Interf eron-gamma, IFN- Y )是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，在机体免疫系统中发挥重要作用。但由于干扰素分子量小、吸收快、半衰期短、容易被酶水解等特点，在临床中需要频繁注射给药才能达到治疗的效果。IgG免疫球蛋白是体内的主要抗体，IgG的Fe片段可以和新生的Fe受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fe片段可以用来与IFNy连接构成融合蛋白，以提高IFN Y在体内的半衰期，达到长效作用的目的；同时IgG可以通过Fe片段上的补体集合位点激活补体，起到细胞杀伤作用；此外，带Fe片段的IFNy融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。目前猪干扰素的批量生产主要有诱导血液淋巴细胞法和大肠杆菌异源表达法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂、生产成本高，产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。相比之下，大肠杆菌异源表达法`具有产量大、纯度高、适合规模化生产、产品质量容易控制等优点，但是其生产工艺相对较繁琐。并且，由于大肠杆菌体系内缺乏蛋白翻译后加工系统，表达产物多以无活性的包涵体形式产生。而包涵体的复性过程复杂、复性率低，从而导致蛋白比活性也较低。另外，大肠杆菌表达体系的产品纯度不高，含有其他杂蛋白，分离纯化较困难。而杆状病毒表达系统作为一种真核表达系统，具有表达效率高、表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使目的蛋白在生化性质及生理活性方面与天然蛋白基本相似、生产成本较低等优点，从而为基因工程干扰素在畜禽养殖业中广泛奠定了基础。因此，本专利技术提供了一种新颖的猪IFN Y-Fe融合蛋白杆状病毒表达体系——家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪IFNy-Fc融合蛋白及其编码基因，以及利用杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统高效表达、生产猪IFN Y-Fe融合蛋白的方法。本专利技术提供了一种猪IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有猪Y干扰素蛋白序列的成熟肽部分，同时，在猪Y干扰素蛋白序列C端的终止密码子之前添加有Fe蛋白序列。本专利技术的上述所述猪IFN Y -Fe融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。本专利技术还提供了一种猪IFNy-Fc第一优化基因，其碱基序列如SEQ ID N0:1所/Jn ο本专利技术还提供了一种猪IFNy-Fc第二优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2所/Jn ο本专利技术还提供了一种猪IFNY-Fc第三优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO:3所/Jn ο本专利技术还提供了一种质粒，所述质粒含有上述所述的猪IFN Y-Fe第一、第二或第三优化基因，所述质粒优选为Bacmid。本专利技术还提供了一种病毒，所述病毒具有上述所述的质粒，所述病毒优选为杆状病毒，最优选为BmNPV。本专利技术还提供了一种猪IFNy-Fc融合蛋白的表达方法，包含如下步骤:(I)在合适的条件下将上述所述的病毒转染家蚕BmN细胞或穿刺接种家蚕幼虫；(2)家蚕BmN细胞或家蚕幼虫表达猪IFN Y -Fe融合蛋白。优选的，所述表达 方法步骤如下:(I)将猪IFN Y -Fe第二优化基因或第三优化基因克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统转移表达载体pFastBac Dual中；(2)通过位点的特异性转座，将转移表达载体上的所述猪IFN Y -Fe第二优化基因或第三优化基因整合入Bacmid杆状病毒质粒完成病毒基因组的重组；(3)将步骤(2)中整合了猪IFN Y-Fe第二优化基因或第三优化基因的杆状病毒质粒转染家蚕BmN细胞，获得重组杆状病毒并完成重组杆状病毒的扩增，并用杆状病毒穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫；所述家蚕幼虫优选为4或5龄的家蚕幼虫；(4)经重组病毒感染的家蚕BmN细胞和经接种的家蚕幼虫可表达猪IFN Y -Fe融合蛋白。本专利技术利用上述表达系统来生产猪IFNy-Fc融合蛋白的优点在于:1.本专利技术的表达方法的表达效率高，因而可大大降低猪IFNy-Fc融合蛋白的生产成本，并使通过基因工程方法大规模生产猪IFN Y-Fe融合蛋白成为可能。2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使目的蛋白在生化性质和生物活性与天然产品类似，从而为所表达的猪IFNy-Fc融合蛋白具有正确的蛋白结构和生物学活性提供了保证。3.与天然猪IFNy相比，本专利技术的猪IFNy-Fc融合蛋白增加了 Fe蛋白片段，延长了猪IFNy-Fc融合蛋白的半衰期，增加了其在体内发挥效应的时间和整体免疫调节作用。此夕卜，Fe片段可以起到蛋白标签的作用，有利于后期目的蛋白纯化及猪IFNy-Fc融合蛋白注射剂的制备。4.家蚕体内有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定，而且家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养，而蚕蛹也是中药中的一味常用中药，所以，本专利技术的通过家蚕表达的猪IFNy-Fc融合蛋白不仅可以经过进一步纯化后制备注射用制剂，而且也可以不经过纯化而经过病毒灭活后直接添加到禽畜(如鸡、猪)的饲料中去。附图说明图1:总实验设计流程图。图2-a、图2-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因序列优化前后在家蚕表达宿主中CAI指数。其中，图2-a表示优化前的猪IFN Y -Fe原始基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数为0.88 ;图2-b表示优化后的猪IFN Y -Fe第一优化基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数为 0.89。图3-a、图3-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图其中，图3-a表示优化前的猪IFNy-Fc原始基因序列在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化前的序列低频密码子出现百分比为1% ;图3-b表示优化后的猪IFN Y-Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的序列低频密码子出现百分比为O。图4-a、图4-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中GC含量分布区域图其中，图4-a表示优化前的猪IFN Y -Fe原始基因序列在家蚕表达宿主中GC含量为45.98% ;图4-b表示优化后的猪IFN Y -Fe第一优化基因密码子在家蚕表达宿主中GC含量为 47.75%。图5-a、图5-b:猪IFN Y -Fe原始基因序列与猪IFN Y -Fe第一优化基因在家蚕表达宿主中mRNA的二级结构示意图其中，图5-a表示优 化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪IFNγ?Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有猪γ干扰素蛋白序列的成熟肽部分，在猪γ干扰素蛋白序列C端的终止密码子之前添加有Fc蛋白序列。

【技术特征摘要】
1.种猪IFNy-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有猪、干扰素蛋白序列的成熟肽部分，在猪Y干扰素蛋白序列C端的终止密码子之前添加有Fe蛋白序列。2.权利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0:4所示。3.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括在猪Y干扰素蛋白序列的成熟肽部分之前添加的gp64信号肽序列。4.种编码权利要求3中所述的融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO:2或SEQID NO:3 所示。5.种质粒，所述质粒具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，钱林，徐春林，陈晨，王耀方，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：