一种脂肪酶抑制剂的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种脂肪酶抑制剂的筛选方法，具体涉及一种利用薄层色谱生物自显影技术筛选脂肪酶抑制剂的方法，将供试品溶解于水和/或有机溶剂中，然后将供试品溶液点涂于薄层板上，并将该板放入展开剂中展开、取出、晾干、备用；将上述步骤中得到的薄层板浸渍于底物溶液中，挥干溶剂后再浸渍于脂肪酶溶液中，取出薄层板并置于温度为20℃-40℃条件下进行酶促反应，待反应完全后将薄层板浸渍于显色剂溶液中进行显色反应，得到紫色背景下的白色和/或棕黄色斑点结果图。所述脂肪酶抑制剂的筛选方法不需要复杂的仪器和设备，操作简单，实验耗费低，适合一般实验室操作，而且灵敏度和专属性高于常规筛选方法，筛选结果直观、易于辨识和记忆。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体涉及一种利用薄层色谱生物自显影技术筛选脂肪酶抑制剂的方法。
技术介绍
脂肪酶又称三酰基甘油酰基水解酶，是一类促进脂质(如甘油三酯、脂肪、油等)水解或合成的水溶性酯酶。它普遍存在于动植物和微生物中。而人体的胰脏和脂肪组织中含有较多的脂肪酶，肠液和胃液中也含有一定量的脂肪酶，各类脂肪酶控制着消化、吸收、 脂肪重建和脂蛋白代谢等过程。近年来，随着人们生活水平的提高和生活方式的变化，脂质代谢紊乱的患病率快速攀升，其不仅是动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的重要危险因素，同时还与糖尿病、脂肪肝、肾病、高血压、肥胖症及代谢综合征等诸多常见重大疾病密切相关。目前，医学界公认的脂质代谢紊乱调节途径包括一、降低甘油三酯含量； 二、降低低密度脂蛋白胆固醇含量；三、升高高密度脂蛋白胆固醇含量。现在，主要应用他汀类药物通过第三种途径降低胆固醇，而前两种调解途径均可以通过脂肪酶抑制剂来得以实现。脂肪酶抑制剂能有效抑制胃/胰脂肪酶活性，减少胃肠道饮食脂肪水解，抑制脂肪组织释放非酯化脂肪酸，从而减少甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇的合成，最终使血清总胆固醇和甘油三酯水平下降，通过外源性代谢途径调节脂质代谢。目前，临床主要应用的脂肪酶抑制剂是奥利司他，但是，2010年5月美国食品药品监督管理局(FDA)警告其存在可能引起严重肝损害的风险；2011年3月4日，我国药品不良反应监测中心也发布了第36期 《药品不良反应信息通报》要求关注奥利司他安全性问题。相比之下，天然药物来源的脂肪酶抑制剂的成分作用温和、毒副作用小、来源广泛以及价格相对低廉等优势突显。近年来针对天然药物来源的脂肪酶抑制剂的筛选一直是相关领域的研究热点，如苦丁茶提取物、葡萄种籽提取物、木犀草素及熊果酸等均具有抑制脂肪酶的活性。但是传统的体内、体外多种实验的筛选方法对有效化合物的纯度及应用量均有较高要求，而天然药物的药效成分不明确，且多为多成分、多靶点协同作用，给天然药物来源的脂肪酶抑制剂的筛选带来困难，而且该种筛选方法需要消耗大量样品，劳动强度大，不能适应大量药品的同时筛选。采用紫外分光光度法及MTT比色法进行脂肪酶筛选时受到溶剂和样品浓度的限制，因此受试样品的范围小。所以，建立快速从天然药物提取物中筛选出具有抑制脂肪酶活性的成分及评价方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是，针对上述技术的不足而提供了一种利用薄层色谱生物自显影技术，快速从天然产物或单体化合物中筛选脂肪酶抑制剂的方法，该方法操作简单、实验耗费低、灵敏度和专属性高。本专利技术的筛选方法为薄层色谱生物自显影法，通过如下步骤实现(I)将供试品溶解于水和/或有机溶剂中，然后将供试品溶液点涂于薄层板上，并将该板放入展开剂中展开、取出、晾干、备用。所述有机溶剂可以是体积溶度为90% 98% 的甲醇溶液或是乙醇溶液。(2)将步骤(I)中得到的薄层板浸溃于底物溶液中，挥干溶剂后再浸溃于脂肪酶溶液中，取出薄层板并置于温度为20°C -40°C条件下进行酶促反应，酶促反应时间为5-60 分钟。待反应完全后将薄层板浸溃于显色剂溶液中进行显色反应，显色反应时间为5-60分钟。所述薄层板为硅胶板。所述步骤(I)中的供试品溶液的点样量为1-20 μ L，供试品的点样量为10pg-lmg。。所述步骤(I)中所述的展开剂为石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水、醋酸铵等中的一种或几种的混合物。优选的，将石油醚和乙酸乙酯按照体积比为2:1的比例混合配制成展开剂。所述底物溶液为肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶解于石油醚的溶液，肉豆蘧酸-2-萘酯溶液的浓度为O. 25-350mmol/L。所述步骤(2)中的脂肪酶溶液的配制方法是，先将三羟甲基氨基甲烷和无水氯化钙粉按照重量比为2. 5-4. 5:1的配比溶于去离子水中，调节混合液的pH值为6. 5-8. 0，配制成三羟甲基氨基甲烷摩尔浓度为20-100mmol/L的酶促反应缓冲液并冷藏保存；将脂肪酶溶解于所述酶促反应缓冲液，配制成浓度为5-200u/mL的脂肪酶溶液。所述显色剂溶液为固蓝B盐溶液，浓度为O. 1-lOOmg/mL。薄层色谱生物自显影法是结合了比色法与色谱分离技术两者的优点，是一种集鉴定、分离和活性测定于一体的药物筛选方法。筛选原理为脂肪酶通过酶促反应产生的 β -萘酚与固蓝B盐显色反应产生紫色物质，具有抑制脂肪酶活性的物质抑制该反应发生， 在薄层板上表现为紫色背景下的白色和/或棕黄色斑点。本专利技术的优点是1、所述脂肪酶抑制剂的筛选方法不需要复杂的仪器和设备，操作简单，实验耗费低，适合一般实验室操作，而且灵敏度和专属性高于常规筛选方法。2、以彩色图像形式提供筛选结果，形象直观，易于辨识和记忆。3、筛选过程以薄层板为媒介，不受溶剂和样品浓度的限制，使得受试样品的种类更为广泛。4、能从天然药物中快速筛选出具有抑制脂肪酶活性的成分，而且相对与合成药物，该天然脂肪酶抑制剂的价格相对低廉， 副作用小，使消费者获得更大益处。附图说明图I为实施例图2为实施例图3为实施例图4为实施例图5为实施例图6为实施例图7为实施例图8为实施例I中两种北沙参提取物的活性筛选结果图。 2中奥利司他的活性检测结果图 3中奥利司他的检测限检测结果图。4中齐墩果酸的活性筛选结果图。5中迷迭香酸的活性筛选结果图。6中木犀草素的活性筛选结果图。7中葡萄籽水提物的活性筛选结果图。8中白藜芦醇的活性筛选结果图。4图9为实施例9中β -谷甾醇的活性筛选结果图。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术作进一步说明实施例I酶促缓冲液的配制准确称量三羟甲基氨基甲烷粉末I. 212g和无水氯化钙粉末 O. 455g溶剂于去离子水中，用盐酸调节混合液的pH值至6. 5，用去离子水将溶液最终定容至500mL，配制成三羟甲基氨基甲烷浓度为20mmol/L的酶促反应缓冲液(pH=6. 5)，置于 2-4 °C冰箱中保存、备用。底物溶液的配制将肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚溶解中，配制成浓度为 16mmol/L的底物溶液。脂肪酶溶液的配制在上述酶促缓冲液中加入猪胰脂肪酶，配制成浓度为lOu/mL 的溶液。显色剂溶液的配制将固蓝B盐粉末溶于去离子水中，配制成浓度为O. 5mg/mL的显色剂溶液。供试品溶液的制备分别称取两种北沙参药材细粉(选自安徽亳州药材市场)各 2g，分别加入体积浓度为95 %的甲醇溶液50mL，超声波处理30分钟后过滤、滤液弃去，在药渣中加入ImL甲醇溶液溶解，得到两种北沙参供试品溶液。将上述供试品溶液分别点于两块娃胶板上，点样量均为20 μ L,然后将娃胶板置于层析缸中展开后，展开剂为体积比为2:1的石油醚与乙酸乙酯的混合液，取出硅胶板并挥干展开剂，备用。将上述硅胶板浸溃于底物溶液中，挥干溶剂后再浸溃于脂肪酶溶液中，然后将硅胶板放置于26°C条件下反应6分钟。反应完成后将硅胶板浸溃于显色剂中，26°C条件下显色反应15分钟。结果见附图I所示，具有抑制脂肪酶活性的物质，发生了抑制反应的在薄层板上表现为紫色背景下的白色和/或棕黄色斑点。实施例2酶促缓冲液的配制准确称量三羟甲基氨基甲烷粉末3. 029g和无水氯化钙粉末O.91g溶剂于去离子水中，用盐酸调节混合液的pH值至7. 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪酶抑制剂的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法为薄层色谱生物自显影法，其步骤包括：（1）将供试品溶解于水或有机溶剂或水与有机溶剂的混合物中，然后将供试品溶液点涂于薄层板上，并将该板放入展开剂中展开、取出、晾干、备用；（2）将步骤（1）中得到的薄层板浸渍于底物溶液中，挥干溶剂后再浸渍于脂肪酶溶液中，取出薄层板并置于温度为20℃?40℃条件下进行酶促反应，待反应完全后将薄层板浸渍于显色剂溶液中进行显色反应。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴弢，唐吉鹤，陶宏迅，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：