一种核酸检测方法技术

本发明专利技术公开了一种核酸检测方法，包括：(1)根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物；(2)将待测的DNA或RNA的逆转录产物预处理后，与锁式探针、连接酶和缓冲液混合，连接反应后加热使连接酶变性失活；(3)以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；(4)滚环扩增完成后，往滚环扩增体系中添加磁珠，使扩增产物聚集，然后整体转移至滤纸上，晾干；(5)肉眼观察滤纸表面，判断待测的DNA或RNA中是否含有目标核酸分子。本发明专利技术方法所需实验装置简单，仅需要移液器、恒温加热器即可完成整个检测，与常规方法相比，成本大为降低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物分子检测技术，尤其涉及。
技术介绍
基于核酸检测的分子诊断技术除血液学、病理学、免疫学和微生物学之外的一项崭新的疾病诊断技术，目前正在越来越广泛地用于临床，为疾病的预防、预测、诊断、治疗提供信息和决策依据。实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是应用最为广泛的核酸检测技术之一，具有高灵敏度和高特异性等特 点，可弥补传统生理和免疫诊断技术在灵敏度和检测时间方面的不足。但是，目前商品化qPCR仪通常都包括两个重要部件，循环温度控制系统和荧光检测系统，导致仪器体积庞大，价格昂贵，且不方便携带和移动。而且绝大多数qPCR和qRT-PCR技术都用到荧光探针，也很大程度上提高了检测成本。上述原因导致大多数分子诊断技术只能够在经济发达、交通便利的中心城市和发达国家的医院、医疗机构中使用，不能够普及到广大农村、偏远地区和发展中国家的大多数地区。而正是在这些国家和地区，每年有更多的穷人和儿童因为医疗卫生条件差、食品短缺、环境恶劣等自然和人为因素，得不到及时诊断和治疗，患上甚至死于各种疾病，尤其是传染性疾病。因此，开发体积小，成本低，灵敏度高，特异性好的新型检测技术具有无比重要的意义。围绕这一目标，全世界的科学家多年来为之做出了不懈的努力，也取得了一些令人振奋的成果。例如将传统P CR仪器微型化、集成化的m i c r ο -P CR芯片实验室(Lab-on-a-chip)技术、纸芯片技术、试纸条传感器和显色技术等。其中，芯片实验室虽然可以将传统PCR仪的部分结构(例如循环温控系统、样品盘、检测器等)微型化，但是将整个PCR系统微型化仍然面临很多问题，而且芯片系统的成本目前还比较高。纸芯片和试纸条技术目前仅限于蛋白检测和免疫分析，而且灵敏度也不高。由美国西北大学Mirkin教授课题组早年提出的纳米金修饰探针聚集的方法，虽然可以达到很高的灵敏度，该方法虽然可以识别特异序列，但是目标分子必须是短的单链核酸，通常只有20-30个碱基，不适合基因分析。此外，该方法还受限于溶液盐浓度、金属离子的种类和浓度等条件，特别是酶溶液中经常用到的还原剂二硫苏糖醇(DTT)容易引起纳米金的聚集，不利于其广泛应用。最近，美国弗吉尼亚大学Landers教授课题组发表了一项利用旋转磁场引起磁珠聚集的非标记核酸检测技术，该方法只适用于非特异性核酸分析(例如总DNA、基因组DNA含量等)。而他们设计的特异序列分析方案基于纳米金修饰探针聚集的方法类似，同样存在前述问题，而且，由于磁珠体积通常是微米级(而纳米金颗粒一般只有几十纳米)，庞大的体积不利于探针杂交引起聚集的效果。因此，该技术不能够满足大多数基因分析的要求，不具有广泛适用性。中国专利申请200810027652. 9公开了基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，该方法利用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针与转基因物种的靶基因杂交后在DNA连接酶的作用下形成环化单链探针，该探针在恒温条件下被生物素复制引物滚动复制和支链扩增，产生含有多个串连重复片段的生物素化滚环扩增产物，扩增产物与钌标记的DNA探针杂交，再通过链霉亲和素包被的磁珠分离、电化学发光检测，判断转基因的有无。该专利公开的方法最终需要通过仪器来检测目标核酸是否存在，系统复杂，且操作不够简便。
技术实现思路
本专利技术提供了，解决了传统方法最终需要通过检测仪器识别目标分子，操作复杂的问题。，包括(I)根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物；(2)将待测的DNA或RNA的逆转录产物预处理后，与锁式探针、连接酶和缓冲液混合，连接反应后加热使连接酶变性失活； (3)以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；(4)滚环扩增完成后，往滚环扩增体系中添加磁珠，使扩增产物聚集，然后整体转移至滤纸上，晾干；(5)肉眼观察滤纸表面，判断待测的DNA或RNA中是否含有目标核酸分子。所述目标核酸分子为DNA、mRNA或microRNA,所述目标核酸分子在待测的DNA或RNA中拷贝数不低于107。所述待测的DNA或RNA浓度和总量较小，一般在I IOOng范围内。所述待测的DNA或RNA —般是指从生物体中提取的总DNA或总RNA，其中RNA需要逆转录为DNA，否则锁式探针无法与目标核酸分子配对，因此加入连接体系的是其逆转录产物。所述生物体可以是病毒、细菌、植物、动物，可以是单细胞、多细胞或者组织，提取方式可以参照现有公开的核酸提取方法。从细胞中提取的DNA —般为双链结构，因此先用限制性内切酶(如Alu I和HinfI)酶切处理，获得短的双链DNA，再经外切酶(如Exo III)处理，获得单链DNA。RNA的逆转录产物经核酸酶降解后，可以获得单链的DNA，因此不需要进行上述的酶切处理。所述的预处理就是将提取的双链DNA分解成短的单链DNA，将逆转录产物与单链DNA杂交的RNA模板利用核酸酶降解。 所述锁式探针是指两个末端可以与靶目标序列毗邻互补的核苷酸序列，在连接酶作用下可以环化，得到滚环探针，该滚环探针即为连接产物，作为步骤(3)中滚环扩增的模板。所述连接酶只要能够将锁式探针两个末端连接即可，但连接酶的连接效率和对序列的识别能力直接影响检测的灵敏度和特异性，它可以是Taq DNA连接酶、Ampligase DNA连接酶、Thermus thermophilus (Tth)连接酶、T4DNA 连接酶、T4RNA 连接酶或 E. coli DNA连接酶，优选为 Taq DNA 连接酶、Ampligase DNA 连接酶或 Thermus thermophilus (Tth)连接酶；最优选为Taq DNA连接酶，该连接酶反应温度较高，不易与突变序列杂交形成双链。锁式探针长度影响连接效率，也影响滚环扩增的时间，其长度优选为40 200bp，更优选为60 IOObp。所述扩增引物的长度10 40bp，更优选为20 30bp。理论上，滚环扩增时间越长，聚集显色效果越明显，滚环扩增时间太短，肉眼无法观测到，得到假阴性的结果。所述滚环扩增的时间为至少60分钟，更优选为至少120分钟。所述磁珠是为超顺磁性纳米微球，它基本由内部的磁核、中间的高分子材料以及外部包裹层组成，直径大致在IOOnm 10 μ m。磁核由Fe2O3和Fe3O4磁性材料组成,高分子材料构成保护层，可以选用如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、多糖、球蛋白和牛血清蛋白等。包裹层为修饰基团或结合物，本专利技术磁珠外表面修饰的为可与滚环扩增产物结合的羧基、氨基或抗生物素蛋白，优选抗生物素蛋白修饰磁珠。所述磁珠的形状可以为正球形、椭球形和棒状等，也可以具有粗糙表面。优选磁性强、不规则形状和具有粗糙表面的磁珠。所述磁珠也可以为市售商品，可以是美国invitrogen公司生产的l)ynabcads‘X_ MyOne Streptavidin Cl磁珠,或是中国天津贝思乐公司生产的Affimag PSC系列磁珠。与现有技术相比较，本专利技术有益效果为(I)本专利技术方法所需实验装置简单，仅需要移液器、恒温加热器即可完成整个检测，与常规方法相比，成本大为降低，特别适用于缺少昂贵临床设备的基层医疗机构、偏远地区和经济不发达地区。(2)本专利技术方法还具有普遍适本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸检测方法，包括：(1)根据目标核酸分子的序列设计合成锁式探针和扩增引物；(2)将待测的DNA或RNA的逆转录产物预处理后，与锁式探针、连接酶和缓冲液混合，连接反应后加热使连接酶变性失活；(3)以连接产物为模板，利用扩增引物进行滚环扩增；(4)滚环扩增完成后，往滚环扩增体系中添加磁珠，使扩增产物聚集，然后整体转移至滤纸上，晾干；(5)肉眼观察滤纸表面，判断待测的DNA或RNA中是否含有目标核酸分子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚波，林彩琴，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：