级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及级联侵入信号放大反应和纳米金-寡核苷酸探针可视化检测。本发明专利技术级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法包括1)第一步侵入信号放大反应，形成flap片段的积累；2)flap片段循环阶段，将flap片段与发夹探针互补杂交，形成flap片段-发夹探针特殊结构，该结构被酶识别后，发夹探针被切割；3)纳米金-寡核苷酸探针检测阶段，利用两种不同寡核苷酸修饰的纳米金探针，可视化检测级联侵入信号放大反应的结果。利用本发明专利技术检测方法，能够对核酸靶序列进行可视化检测，并且由于侵入信号放大反应具有很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及核酸侵入信号放大方法与纳米金-寡核苷酸探针。具体涉及一种。
技术介绍
核酸检测已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染性疾病的预防与控制等很多方面。目前常用的核酸检测技术大多基于模板扩增原理，即扩增产物与靶核酸序列相同，如聚合酶链式反应技术(Polymerase Chain Reaction, PCR)、环介导的核酸等温扩增技术(Loop-MediatedIsothermal Amplification, LAMP)、滚环扩增技术(Rolling Cycle Amplification, RCA)、基于核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA)、转录酶介导的扩增技术(Transcription MediatedAmplification,TMA)、解链酶扩增技术(Helicase DependantAmplification,HDA)、链置换扩增技术(Strand Displacement Amplification, SDA)等。上述核酸扩增方法由于扩增产物与靶核酸序列相同，因此极易造成产物交叉污染，使核酸检测经常出现假阳性的结果。为了避免扩增产物的交叉污染，近年来发展了一些不扩增靶核酸，而是由靶核酸引发其他信号分子扩增，间接地对靶核酸进行检测的核酸信号扩增检测方法，如分枝DNA法(Branch_DNA,B_DNA)、核酸侵入信号扩增实验(Invader Assay)以及一些基于电化学检测的信号扩增法。其中，B-DNA法及核酸侵入信号扩增实验均有较高的灵敏度，但它们都需要合成特殊结构或特殊荧光标记的探针，提高了检测成本；而基于电化学检测的信号扩增法往往灵敏度较低，达不到核酸检测的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于信号放大和纳米金-寡核苷酸探针的可视化核酸检测方法，即提供一种。本专利技术的目的通过以下技术方案实现本专利技术利用纳米金-寡核苷酸探针，可视化检测级联侵入信号放大反应结果，建立了一种高灵敏度的可视化的核酸检测方法。本方法依次包括以下步骤(反应原理如图2所示)(I)级联侵入信号放大反应的第一步核酸侵入信号扩增阶段设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针I个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’ flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1°C范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’ flap内切酶的酶切反应温度5 10°C;所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’ flap内切酶，核酸5’外切酶或5’ flap内切酶识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’ flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’ flap内切酶切割，形成flap片段的积累；(2)级联侵入信号放大反应的flap片段循环信号扩增阶段反应体系中的发卡探针可捕获步骤(I)积累的flap片段，并杂交形成一个flap片段-发夹探针特异性结构，该结构也可被反应体系中的核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别，并将发夹探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，被切割的发夹探针与步骤(I)产生的flap片段分离，没有被切割的完整的发夹探针会再次与步骤(I)产生的flap片段杂交，再次形成所述的flap片段-发夹探针特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，从而大量的发夹探针被切表1]； 3)级联侵入信号放大反应结果纳米金-寡核苷酸探针可视化检测阶段由于发卡探针5’端和3’端可分别与两种纳米金-寡核苷酸探针互补杂交，可使得纳米金-寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网状结构，从而引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，并由此引发粒子光学性质的改变，产生发卡探针的检测信号，即反应体系从红色变为紫色；当反应体系中有靶核酸存在时，可触发级联信号放大反应，在酶的作用下，大量发卡探针被切割；待级联信号放大反应结束后，向反应体系中加入两种纳米金-寡核苷酸探针；这时，由于发卡探针被切割，不能将两种纳米金-寡核苷酸探针连接，则不能引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，反应体系颜色不发生变化，仍然为红色；相反，当反应体系中不存在靶核酸或靶核酸浓度过低时，则无级联信号放大反应发生或级联信号放大反应作用不明显，体系中存在的发卡探针可使得纳米金-寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网状结构，反应体系颜色由红色变为紫色，从而显示该体系中无靶核酸存在或靶核酸浓度过低。上述的可视化核酸检测方法，其在于该方法能够检测到浓度为lOfmol/L的靶核酸序列。上述的可视化核酸检测方法，其在于所述的靶核酸为DNA或RNA。上述的可视化核酸检测方法，其在于所述的核酸侵入反应体系包含MOPS、Tween-20, Nonidet P40、上游探针、下游探针、发夹探针、MgCl2以及靶核酸。优选为IOmmoI/L MOPS, pH 7. 5,0. 05 % Tween-20,0. 05 % Nonidet Ρ40，0· I μ mol/L 上游探针，O.2 μ mol/L下游探针，0. 2 μ mol/L发夹探针，7. 5mM MgCl2和靶核酸。上述的可视化核酸检测方法，其在于所述的核酸5’外切酶或5’ flap内切酶选自TaqPoI、TthPoI、TaqExo、AfuFEN, PfuFEN, MjaFEN 或 MthFEN。优选为 AfuFEN。上述的可视化核酸检测方法，其在于步骤⑴或(2)所述的反应温度可以通过恒温水浴仪实现；步骤(3)所述的纳米金-寡核苷酸探针检测结果可通过人眼直接观察，或拍照保存结果。本专利技术的有益效果在本专利技术整个核酸信号扩增检测方法过程中，只有第一步核酸侵入信号扩增中的上、下游探针需要针对不同模板进行设计，其它各步骤中的成分均可通用，并且上、下游探针和发夹探针不需要任何修饰，成本低。由于核酸5’外切酶或5’ flap内切酶仅识别上下游探针形成的特异结构，对模板序列没有要求，所以本方法可以检测任意模板，而无序列限制。本专利技术中使用的发夹探针，其3’端和5’可分别与两种纳米金-寡核苷酸探针杂交，可利用该探针的这一性质，实现对级联侵入信号放大反应的可视化检测。利用本专利技术提供的方法进行核酸检测时，扩增产物与靶核酸序列无关，不会造成扩增产物的交叉污染是本专利技术的一大特色。利用本专利技术检测方法，能够对核酸靶序列进行检测，并且由于核酸侵入反应具有 很高的特异性，可以实现对侵入位点附近的单个碱基差异的核酸序列进行区分检测。附图说明图I为核酸侵入反应中核酸5’外本文档来自技高网...

【技术保护点】
级联侵入信号放大反应结合纳米金？寡核苷酸探针可视化核酸检测方法，其特征在于依次包括以下步骤：(1)级联侵入信号放大反应的第一步核酸侵入信号扩增阶段：设计针对靶核酸特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3’端必须侵入下游探针1个碱基，下游探针有一段翘起片段，称为5’flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度在核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度±1℃范围内，而上游探针与靶核酸互补区域的解链温度要高于核酸5’外切酶或5’flap内切酶的酶切反应温度5～10℃；所述的靶核酸与所述的上、下游探针在核酸侵入反应体系中杂交形成探针？靶核酸特异性结构，其中下游探针浓度大于上游探针浓度；向反应体系中加入核酸5’外切酶或5’flap内切酶，核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别所述的探针？靶核酸特异性结构，并将下游探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，可以牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完整的下游探针再次形成所述的探针？靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，形成flap片段的积累；(2)级联侵入信号放大反应的flap片段循环信号扩增阶段：反应体系中的发卡探针可捕获步骤(1)积累的flap片段，并杂交形成一个flap片段？发夹探针特异性结构，该结构也可被反应体系中的核酸5’外切酶或5’flap内切酶识别，并将发夹探针的5’flap连同与模板配对的第一个碱基切下，被切割的发夹探针与步骤(1)产生的flap片段分离，没有被切割的完整的发夹探针会再次与步骤(1)产生的flap片段杂交，再次形成所述的flap片段？发夹探针特异性结构，进而继续被核酸5’外切酶或5’flap内切酶切割，从而大量的发夹探针被切割；(3)级联侵入信号放大反应结果纳米金？寡核苷酸探针可视化检测阶段：由于发卡探针5’端和3’端可分别与两种纳米金？寡核苷酸探针互补杂交，可使得纳米金？寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒？多核苷酸的多聚网状结构，从而引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，并由此引发粒子光学性质的改变，产生发卡探针的检测信号，即反应体系从红色变为紫色；当反应体系中有靶核酸存在时，可触发级联信号放大反应，在酶的作用下，大量发卡探针被切割；待级联信号放大反应结束后，向反应体系中加入两种纳米金？寡核苷酸探针；这时，由于发卡探针被切割，不能将两种纳米金？寡核苷酸探针连接，则不能引发纳米金的特征等离子吸收发生变化，反应体系颜色不发生变化，仍然为红色；相反，当反应体系中不存在靶核酸或靶核酸浓度过低时，则无级联信号放大反应发生或级联信号放大反应作用不明显，体系中存在的发卡探 针可使得纳米金？寡核苷酸探针形成伸展的纳米金颗粒？多核苷酸的多聚网状结构，反应体系颜色由红色变为紫色，从而显示该体系中无靶核酸存在或靶核酸浓度过低。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周国华，马寅姣，邹秉杰，
申请(专利权)人：华东医学生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：