【技术实现步骤摘要】
基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法和试剂盒。
技术介绍
食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，会对人类健康造成极大危害，是食品安全的重大隐患。近20年间，食源性致病菌所引起的食品安全问题一直在增长。因此，开展LM (Listeria monocytogenes)流行性分型研究对预防食源性李斯特菌病的流行具有十分重要的意义。快速、高特异性、高灵敏度的检测食品致病菌的致病亚型不仅可以快速诊断致病的原因，在现实生活中还能预防肠道传染病和食物中毒的发生。目前食源性致病菌亚型的检测方法主要依靠脉冲电场凝胶电泳、低频限制性切割位点聚合酶链式反应、随意扩增多态性、扩增片段长度多态性、多位点酶电泳和多位点测序分型等6种用于细菌分型的分子生物学技术。但这些方法均存在检验周期长，需要昂贵的仪器等缺点。在重大疫情发生时，不能及时的判定致病菌的亚型，从而做出准确快速有效的治疗方案。所以食源性李斯特菌致病菌亚型的快速检测成为一个亟待解决的问题。
技术实现思路
为克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法。该方法基于非对称PCR结合胶体金核酸试纸条进行简便、灵敏度高、探针设计简单、操作步骤简短及特异性高的检测食品中食源性致病菌的方法，及时快速的获知食品中食品中食源性致病菌的污染情况。本专利技术的另一目的在于提供`一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特...
【技术保护点】
一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于具体包括如下步骤：（1）食品致病菌亚型基因组DNA的提取提取食品致病菌亚型的基因组DNA；（2）扩增引物及核酸探针序列设计根据步骤（1）得到的食品致病菌亚型的基因组的保守序列设计两对对称PCR的引物，包括用来标识T线的基因的前引物1和后引物2，及用来标识IACL线的基因的前引物3和后引物4；设计一条与基因组序列不能完全互补配对的一段共用序列；胶体金标记探针：设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列互补配对的标记在胶体金上且3’添加有一段多聚T尾的探针序列；CCT线捕捉探针：设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列相同且3’添加有一段多聚T尾的CCT线捕捉探针序列；IACL线捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的内部控制线捕捉探针；T线捕捉探针：设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的T线捕捉探针；（3）非对称PCR扩增反应扩增反应：反应体系包括步骤（1）提取的基因组DNA、步骤（2）中所述的前引物1和后引物2、前引物3和后引物4、共用序列、dNTP、聚合酶及聚合酶缓冲液和双...
【技术特征摘要】
1.一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于具体包括如下步骤: (1)食品致病菌亚型基因组DNA的提取 提取食品致病菌亚型的基因组DNA ； (2)扩增引物及核酸探针序列设计 根据步骤(1)得到的食品致病菌亚型的基因组的保守序列设计两对对称PCR的引物，包括用来标识T线的基因的前引物I和后引物2，及用来标识IACL线的基因的前引物3和后引物4 ； 设计一条与基因组序列不能完全互补配对的一段共用序列； 胶体金标记探针:设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列互补配对的标记在胶体金上且3’添加有一段多聚T尾的探针序列； CCT线捕捉探针:设计一条3’端修饰有功能基团并与共用序列相同且3’添加有一段多聚T尾的CCT线捕捉探针序列； IACL线捕捉探 针:设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的内部控制线捕捉探针； T线捕捉探针:设计一条5’端修饰有功能基团且5’添加有一段多聚T尾的T线捕捉探针； (3)非对称PCR扩增反应 扩增反应:反应体系包括步骤(1)提取的基因组DNA、步骤(2)中所述的前引物I和后引物2、前引物3和后引物4、共用序列、dNTP、聚合酶及聚合酶缓冲液和双蒸水； (4)纳米金探针的制备 纳米金的制备:用柠檬酸盐还原法以氯金酸为原料制备纳米金； 纳米金探针的制备:将步骤(2)中所述的胶体金标记探针与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针； (5)胶体金核酸试纸条的制备 胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将底板、样品板、金垫、NC膜和吸水板进行组装:底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠； 所述的金垫包埋有步骤(4)制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素的检测线、含链霉亲和素的内部控制线和含链霉亲和素的控制线； (6)样品的检测 将由步骤(3)得到的退火杂交产物与柠檬酸钠缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加柠檬酸钠缓冲液，读取结果，检测线、内部控制线和控制线都变成红色表明有靶片段存在，即有待测食品致病菌亚型；仅有控制线变成红色，表明完全没有所检测的食品致病菌亚型；控制线和内部控制线变成红色表明检测菌种为所检测的食品致病菌但不是待检测的亚型。2.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的食品致病菌亚型的基因组的保守序列为食品致病菌所测亚型特有保守的基因片段。3.根据权利要求2所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于:所述的食品致病菌所测亚型特有保守的基因片段为李斯特菌的prs基因或单增李斯特菌4b型亚型特有的GenBank:GE305625.1的0RF2819基因片段。4.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的胶体金标记探针的功能基团为巯基； 步骤(2)中所述的CCT线捕捉探针的功能基团为生物素； 步骤(2)中所述的IACL捕捉探针的功能基团为生物素； 步骤(2)中所述的T线捕捉探针的功能基团为生物素，多聚T尾中T的数量为8~12个。5.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的共用序列为20~25个核苷酸构成的序列；所述的共用序列不能和基因组互补配对，就不会发生非特异性扩增。6.根据权利要求1所述的基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别食品致病菌亚型的方法，其特征在于:所述的食品致病菌亚型为单增李斯特菌4b型亚型；一种基于非对称PCR结合试纸条平台快速鉴别单增李斯特菌4b型亚型的方法如下: 步骤(2)中用来标识T线的基因为GenBank:GE305625.1的ORF2819基因片段，其PCR引物序列为:前引物 1: 5 ’ -AGCAAAATGCCAAAACTCGT-3 ’ ； 后引物2: 5’ -CCCCCATATATATATATCCCCCCCATCACTAAAGCCTCCCAITG-3’ ；用来标识 IACL 线的基因为PRS基因，其PCR引物序列为:前引物3:5’ -GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3’ ；后引物 4:5’ -CCCCCATATATATATATCCCCCCCAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3’ ； 步骤(2)中所述的共用序列 5 为 5’ -CCCCCATATATATATAT\CCCCCC-3’ ； 步骤(2)中所述胶体金标记探针序列为:5’ -GGGGGGATATATATATATGGGGGTTTTTTTTTTTT-SH-3’ ； 步骤(2)中所述CCT线捕捉探针序列为:5’ -CCCCCATATATATATATCCCCCCTTTTTTTTTTTT-Bio-3’ ； 步骤(2)中所述IACL线捕捉探针序列为:5’ -Bio-TTTTTTTTTTTTCTTCTTTCGCAATCTCTTCAGC-3?； 步骤(2)中所述的T线捕捉探针序列为:5’ -BioTTTTTTTTTTTTACGAGTTTTGGCATTTTGCT-3’ ； 步骤(3)中所述的聚合酶及聚合酶缓冲液为Taq DNA聚合酶及其相配的商品化的缓冲液； 步骤(3)中所述的扩增反应的条件为:95°C反应5min ;接...
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