本发明专利技术涉及一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法，包括步骤：A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog；B)采用步骤A)所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到山羊可诱导多能干细胞。本发明专利技术有助于确立山羊ES细胞建系的最适培养条件和方法；山羊可诱导多能干细胞是山羊基因打靶的良好载体，山羊可诱导多能干细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事件。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种山羊由成体细胞重编程为类似胚胎干胞的可诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,简称iPS细胞)的制备方法。
技术介绍
山羊在畜牧、医药方面都有巨大的应用前景，通过对山羊胚胎干细胞(ESC)系进行操作可以产生克隆动物或者转基因动物，对建造人类疾病模型、器官移植、改良物种、增加经济效益等方面意义重大。ESCs是指来源于哺乳动物囊胚内细胞团的一类细胞。这类细胞呈圆形，核质比很大，自稳定性很好，具有无限增殖、自我更新的能力，能够在体外培养的环境中永久传代，并保持正常核型；ESCs还具有“全能性”，无论在体内还是体外环境，它们都能分化成成体生物所有的细胞类型。建立动物ESC细胞系对于生产转基因动物和克隆动物都具有非常重要的意义。基于胚胎干细胞研究的反向遗传学手段对于遗传学、发育生物学、基因敲除模型的建立等方面具有巨大的推动作用。从25年前小鼠胚胎干细胞获得到现在，人们利用反向遗传学手段不断建立和完善各种小鼠模型(Demers, S. P.，et al. (2007), Cloning and stemcells,9,512-522)。经典的建立ESC细胞系的方法是从囊胚的内细胞团分离出ESCs.但是利用这个方法所建立的真正意义的胚胎干细胞系被报道的哺乳动物只有小鼠(Evans MJ,et al. (1981)，Nature，292，154-156)、恒河猴(Liu，et al. (2008)，Cell Stem Cell,3,587-590)、人(Takahashi K.，et al. (2007)，Cell，131，861-872)和大鼠(Li, etal. (2008)，Cell，135，1299-1310)。而其他多数哺乳动物，包括猪、牛、羊等，虽然也有科学家尝试建立相应胚胎干细胞系，但都没有获得一株被认可的细胞系，其中很重要的一个原因就是没有寻找到适合这些动物ESC全能性维持的培养基。此外，山羊的胚胎发育过程以及维持山羊ESCs全能性的通路研究都不够清楚，导致目前并没有产生山羊ESC细胞系，也就制约了转基因山羊及克隆羊的应用，由上，建立山羊ES细胞系迫在眉睫。2006年8月,Yamanaka实验室利用外源表达0ct4, Sox2, c_Myc, Klf4四个转录因子，成功诱导小鼠胚胎成纤维细胞为类似小鼠胚胎干细胞的“可诱导的多能干细胞”(induced pluripotent stem cells, iPS),这项实验结果说明分化细胞可以通过几个转录因子诱导，重编程到全能性的状态(Takahashi K.，et al. (2006) Cell, 126,663-676)；2007年，人类iPS的建立，进一步验证了该方法的可行性(Takahashi K.，et al. (2007)，Cell, 131,861-872 ；Yu, et al. (2007)，Science, 318,1917-1920)，之后，恒河猴，大鼠，猪等物种的iPS细胞系相继建立。大鼠是iPS细胞系早于ES系建立的先例，尽管iPS细胞并非百分之百的ES细胞，但有理由相信，iPS细胞可以运用到那些使用传统方法无法建立ES细胞的物种上，比如山羊
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种。根据本专利技术的，包括步骤A)构建tet-on可诱导慢病毒载体系统,所述转录因子选自0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV401arge T、hTert ；B)采用步骤A)所得慢病毒载体将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到山羊iPS细胞。根据本专利技术所述的方法，所述山羊成体细胞为山羊原代耳尖成纤维细胞。根据本专利技术所述的方法，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括0ct4、 Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28、Nanog、SV40 largeT、hTert。根据本专利技术所述的方法，所述步骤B)克隆的产生是在感染第12天消化为单细胞按I : 3的比例传代至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上，继续培养14天，挑取克隆。根据本专利技术所述的方法，所述步骤B)的传代培养是将山羊iPS克隆按I : 5 10的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。根据本专利技术所述的方法，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。C)山羊iPS细胞的干细胞多能性鉴定根据本专利技术所述的方法，所述步骤C)山羊iPS细胞的多能性鉴定包括实时定量PCR对山羊iPSC细胞系内源多能性基因的检测，如0ct4、Sox2、nanog被诱导表达，此外CDHK Dnmt3b> TDGF> Daxl> Rexl> Sall4 等干细胞 marker 均被诱导表达；指标为I)碱性磷酸酶表达呈阳性；2)干细胞表面特异标记 SSEA-I (+)、Rexl (+)、SSEA-3 (-)、SSEA_4(_)、Tra-1-60(+)、Tra-1-81(+)、E-Cadherin(+)；3)Nanog基因的启动子区域被去甲基化；4)撤DOX后，山羊外源基因的表达检测，表明外源基因被有效关闭；5)自然分化形成胚状体后,外胚层NeuroD (+)、Fibronectin(+),中胚层Myf5(+)、Enolse3(+)、VEGFR2(+)和内胚层 DCNl (+)、AFP (+)；6)体外随机分化，免疫荧光检测到外胚层Tujl(+)、GFAP(+)，中胚层a_SMA(+)、Myotube (+)，内胚层 FoxA2 (+)；7)山羊iPS细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。根据本专利技术所述的方法，所述畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。本专利技术有助于确立山羊ES细胞建系的最适培养条件和方法；山羊iPS细胞是山羊基因打靶的良好载体，本专利技术的山羊iPS细胞将利于揭示山羊各基因功能和复杂的发育事件；此外，山羊iPS是猪的iPS成功诱导后第一项其它大型偶蹄目物种的iPS，这对于其它动物iPS的诱导有着重大指导意义。附图说明图 I 是病毒载体 Lenti-EFl a -EGFP-tetO-cDNA 和 Lenti-EFl a -rtTA-IRES-EGFP结构图。图2是山羊iPS细胞获得的实验流程图。图3是不同转录因子组合情况下，山羊PEF被诱导所产生的克隆数与碱性磷酸酶检测阳性克隆数统计结果图。图4是山羊iPS细胞形态荧光镜检结果图，其中A :山羊未完全重编程克隆形态B 低倍镜下山羊的ES-Iike克隆C :ES-like克隆形态D :高倍镜下的山羊iPS细胞。图5是山羊iPS细胞表面及多能型marker检测图，其中A :碱性磷酸酶、B =SSEA-UC :SSEA-3、D :SSEA-4、E :Rexl、F :Tra-l_60、G :Tra-l_81、H :E_Cadherin。图6是Realtime PCR检测山羊iPS细胞多能性Marker表达情况电泳图，从左到右依次为山羊耳尖成纤维细胞，山羊iPS细胞8-3，山羊iPS细胞8-4，山羊iPS细胞8-7， 山羊iPS细胞8-9，阴性对照。其中，山羊iPS本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4,Lin28、Nanog、hTert、SV40 IargeT antigen ； B)采用步骤A)所得慢病毒载体，将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到山羊可诱导多能干细胞。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述山羊成体细胞为原代耳尖成纤维细胞。3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因 子的组合形式为0ct4、Sox2、c_Myc、Klf4、Lin28、Nanog、hTert、SV40 IargeT antigen。4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的传代培养是将山羊iPS克隆按I : 5 10的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤C)山羊可诱导多能干细胞的干细胞多能性鉴定。...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖磊，任江涛，朴永俊，何丽夏子，鲍磊，崔春，廖静，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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