修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法技术

本发明专利技术涉及修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂以获得或增强多种理想性质中的任一项的方法，所述性质包括抑制程度、丝氨酸蛋白酶抑制剂被靶丝氨酸蛋白酶切割之后抑制的维持、与丝氨酸蛋白酶的结合速度、中和以及结合亲和性。本发明专利技术还涉及此类修饰的产物和此类产物的用途，尤其是，它们在治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及修饰丝氨酸蛋白酶抑制剂以获得或增强多种理想性质中的任一项的方法。本专利技术还涉及此类修饰的产物和此类产物的用途，尤其是，它们在治疗中的用途。
技术介绍
丝氨酸蛋白酶，也称作丝氨酸内肽酶，是在活性位点包含丝氨酸残基的蛋白消化酶。这些酶在自然界是广泛的，并且在多种生物学功能、包括消化、血液凝固、免疫系统和炎症中发挥作用。由于丝氨酸蛋白酶的广泛分布和功能，这些酶的抑制剂是常见的。在自然界可以发现很多蛋白性的丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且已经开发了用于研究和治疗的很多合成的、 化学的丝氨酸蛋白酶抑制剂。凝血酶是在血液凝固中发挥重要作用的丝氨酸蛋白酶家族的成员；通过该过程， 响应于血管损伤，丝氨酸蛋白酶的循环酶原通过有限蛋白水解被依次激活以产生纤维蛋白凝块。凝血酶与多数酶原和它们的辅因子相互作用，在血液凝固中发挥多种促凝剂和抗凝剂作用(Huntington000 ，和Di Cera(2003))。作为促凝剂蛋白酶，在起始期产生的最初的痕量凝血酶激活因子V(FV)和因子VIII (FVIII)以提供阳性回馈，引起凝血酶的爆发。 凝血酶也可以激活因子XI，激发内在途径。凝血酶将纤维蛋白原切割为纤维蛋白，形成不可溶的凝块。通过凝血酶激活的因子XIII驱动的共价交联，纤维蛋白聚合物被进一步加固和稳定化。凝血酶还促成血小板栓的产生，可能是通过两个机制(a)其通过与蛋白酶激活的受体(PAR)和糖蛋白V相互作用而激活血小板；和(b)通过灭活ADAMTS13，其防止血小板栓的脱稳定化，ADAMTS13是具有1型凝血酶敏感蛋白基序的解离素和金属蛋白酶，其切割von Willebrand因子(VWF)。作为抗凝剂蛋白酶，凝血酶在存在辅因子血栓调节蛋白的情况下激活蛋白C(APC)。APC灭活因子Va(FVa)和因子VlIIa(FVIIIa)，下调凝血酶的产生(Huntington Q005)，Di Cera (2003)，Davie 等人(1991)，Davie (2003)和 Lane 等人 (2005))ο由于凝血酶的重要作用，其是抑制以控制凝结级联的主要靶标，很多凝血酶抑制剂已经被用于治疗和研究很多年了。肝素是原型的凝血酶抑制剂，其作为凝血酶的间接抑制剂发挥作用，意思是其通过抗凝血酶复合物作用，不与凝血酶的活性位点直接相互作用。 凝血酶的间接抑制剂仅能与可溶性凝血酶相互作用，因此，一旦形成凝块，则不能抑制凝血酶。更近期以来，已经分离和/或开发了多种凝血酶直接抑制剂，包括蛭素 (hirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、阿加曲班(argatroban)和达比加群酯(dabigatran etexilate)。这些具有能够抑制可溶形式和与纤维蛋白结合的形式的凝血酶的治疗性优点。然而，此类直接抑制剂具有某些性质，远远达不到最佳。例如，蛭素引起出血风险、依赖于肾功能的药代动力学、缺乏解毒药、有免疫原性和反跳性高凝性。比伐卢定被蛋白水解和肾途径的组合清除，其具有可忽略的免疫原性潜能，但仍具有亚适治疗性质。鉴于丝氨酸蛋白酶抑制剂在治疗上的重要性，需要鉴定显示出改进的性质的另外的丝氨酸蛋白酶抑制剂。特别地，需要鉴定这样的凝血酶直接抑制剂具有抑制可溶形式和与纤维蛋白结合形式的凝血酶的能力但不具有与目前可获得的凝血酶直接抑制剂相关的缺点。
技术实现思路
本专利技术提供了修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂，产生修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂的方法，以及使用修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂例如抑制受试者中的靶丝氨酸蛋白酶的方法。因此，在第一方面，本专利技术提供了产生显示出靶丝氨酸蛋白酶(SP)的增强的抑制的修饰的丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)的方法，包括修饰所述SPI以使所述SPI与其靶SP 的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。在该方面的一个实施方式中，该方法包括将能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基导入 SPI0在另一个实施方式中，方法产生修饰的SPI，其显示出延长的抑制持续时间。在一个实施方式中，所述的一个或多个导入的氨基酸残基是通过置换或插入导入的。在该方面的另一个实施方式中，所述的能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。在一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸序列。在另一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。在另一个实施方式中，所述一个或多个导入的氨基酸包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。在一个实施方式中，靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个残基包括催化性丝氨酸残基。在该方面的另一个实施方式中，该方法进一步包括修饰SPI使其能被中和的步骤，包括将离子电荷区域导入SPI，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。在一个实施方式中，将所述导入的离子电荷区域导向SPI的羧基末端。 在另一个实施方式中，所述导入的离子电荷区域是阴离子电荷区域。在一个实施方式中，所述导入的离子电荷区域包括一个或多个酸性残基。在另一个实施方式中，所述一个或多个酸性残基包括一个或多个谷氨酰胺残基。在另一个实施方式中，所述中和试剂是硫酸精蛋白。在前述方法的示例性实施方式中，SPI是凝血酶抑制剂。在另一个示例性实施方式中，SPI选自由SEQ ID NO 14和17-153中的任一项组成的组。在另一个方面，本专利技术提供了通过任意前述方法可获得的或获得的修饰的SPI，或其片段或功能等同物。在一个实施方式中，所述修饰的SPI是凝血酶抑制剂。在示例性实施方式中，修饰的SPI包含下列共有序列N-末端肽PX1-H-X2-(G)n-(外部位点I结合肽) (SEQ ID NO 771)。在另一个方面，本专利技术提供了显示出靶SP的增强的抑制的修饰的SPI，其中SPI与其靶SP的结合移位靶SP的催化三联体中的一个或多个氨基酸残基，或所述氨基酸残基的一个或多个原子。在该方面的一个实施方式中，修饰的SPI包括能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个氨基酸残基或所述氨基酸残基的一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方式中，修饰的SPI显示出延长的抑制持续时间。在该方面的另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基或其一个或多个原子的一个或多个氨基酸残基包括组氨酸残基。在另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸序列。在另一个实施方式中，能够移位靶SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸序列。在另一个实施方式中，能够移位靶 SP的催化三联体的一个或多个残基的一个或多个氨基酸残基包括甲硫氨酸-组氨酸-赖氨酸-苏氨酸序列。在另一个实施方式中，靶丝氨酸蛋白酶的催化三联体中被移位的一个或多个氨基酸残基包括催化性丝氨酸残基。在该方面的另一个实施方式中，修饰的SPI进一步包括离子电荷区域，其中所述离子电荷区域能够与中和试剂上的相反离子电荷区域相互作用。在一个实施方式中，离子电荷区域向SPI的羧基末端放置。在另一个实施方式中，离子电荷区本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·曼朱纳塔·基尼，许祖尧，昆奇塔帕丹姆·斯瓦米纳坦，库玛·顺德拉墨尔西，
申请(专利权)人：自然环境研究会，
类型：发明
国别省市：