EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了能够简便且以优秀的可信度来判别关于EGFR基因中不同多态性的多态性检测用探针、扩增用引物及其用途。选自P1、P3、P5～P7及P15～P18中的至少一种经荧光标记的寡核苷酸作为多态性检测用探针来使用。

【技术实现步骤摘要】
EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用相关申请的交叉引用本申请要求享有以2010年10月29日提交的日本专利申请号2010-244643为基础的优先权，该申请的全部公开内容通过引用并入本文。
技术介绍
本专利技术涉及EGFR基因的多态性检测用探针、扩增用引物及其应用。表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor：EGFR)是表皮生长因子(EGF)的酪氨酸激酶受体。已知，EGFR在多种实体癌中高度表达，其过表达与癌症的恶性程度或预后相关联。因此，例如，将吉非替尼等EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)作为癌症治疗药物使用。但是，患者中，既有通过吉非替尼肿瘤缩小效果得以提高的情形，也有出现了对吉非替尼的耐药性而无法获得治疗效果的情形。并且，近年，已有研究表明对这类药剂的敏感度与EGFR的突变相关(PLoSMedicine，2005年，Vol.2，No.3，p.225-235和JournalofClinicalOncology，2005年，Vol.23，No.11，p.2513-2520)。已知：上述突变例如是EGFR的第790位和第858位上的替换突变，EGFR基因外显子19中的缺失突变(PLoSMedicine，2005年，Vol.2，No.3，p.225-235和JournalofClinicalOncology，2005年，Vol.23，No.11，p.2513-2520)。上述第790位上的突变是EGFR的第790位氨基酸苏氨酸(T)被替换为甲硫氨酸(M)的突变，序列编号21所示的EGFR基因的部分序列中，第347位碱基胞嘧啶(c)被替换为胸腺嘧啶(t)。上述第858位上的突变是EGFR的第858位氨基酸赖氨酸(L)被替换为精氨酸(R)的突变，序列编号1所示的EGFR基因的部分序列中，第261位碱基胸腺嘧啶(t)被替换为鸟嘌呤(g)。上述EGFR基因外显子19中的缺失突变是上述外显子19中连续几个到十几个碱基缺失的突变，序列编号2所示的EGFR基因的部分序列中，例如，第112-164位碱基中的任何碱基缺失。因此，如果能检测出EGFR基因中有无这样的突变，在治疗前评价对吉非替尼的敏感度，会使更为有效的个体化癌症治疗成为可能。另一方面，已报道了多种检测基因多态性的方法，例如PCR-RFLP(限制性片段长度多态性，RestrictionFragmentLengthPolymorphism)法等。但是，上述PCR-RFLP法操作复杂，并且有扩增产物散布、混入第二次的其他反应的可能。由于存在这样的问题，多态性检测的自动化仍是难题。由于存在这样的问题，近年来，实施了利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测作为基因多态性的检测方法。其是这样的方法：使用与含有检测目标的基因多态性的检测对象序列互补的探针，使检测样品的靶标单链DNA与上述探针形成杂交体(双链DNA)，对该杂交形成体实施加热处理，根据吸光度等信号测定来检测随着温度上升的杂交体解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值，由此判断目标多态性的有无。杂交形成体的同源性越高，Tm值就越高，杂交形成体的同源性越低，Tm值就越低。因此，可以针对含有目标多态性的检测对象序列和与其互补的探针的杂交形成体预先求出Tm值(评价基准值)，然后测定检测样品的靶标单链DNA与上述探针的Tm值(测定值)，如果测定值与评价基准值相同，就能判断靶标DNA中存在目标多态性，如果测定值低于评价基准值，就能判断靶标DNA中不存在目标多态性。“Tm值”是指双链核酸解离的温度(解离温度Tm)，一般将其定义为，260nm处的吸光度达到吸光度完全上升值的50％时的温度。即，对双链核酸(例如含有双链DNA的溶液)进行加热，260nm处的吸光度就会上升。这是因为，双链DNA的两链之间的氢键由于加热发生断裂，解离为单链DNA(DNA的熔解)。当全部双链DNA都解离成为单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA时的吸光度)的约1.5倍，据此可判断为熔解完全。Tm值是根据这种现象设定的。但是，这种利用Tm分析的检测方法根据Tm值来判断至少一个碱基的差异，因此，存在多个基因多态性时，对一个样品的分析也要花费大量的劳力。
技术实现思路
基于上述理由，EGFR基因的多态性检测，例如，对于上述疾病治疗方法的选择来说非常重要。因此，本专利技术的目的是提供下述多态性检测用探针及多态性检测方法，其能够简便且以优秀的可信度来判别关于EGFR基因的一个碱基不同的多态性。为了实现上述目的，本专利技术所用的多态性检测用探针是能检测EGFR基因突变的探针，其特征在于，所述多态性检测用探针包括选自下述P1、P3、P5～P7及P15～P18中的至少一种经荧光标记的寡核苷酸。(P1)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号251～261的11～50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号251对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P3)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257～261的5～50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，与碱基编号257对应的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P5)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104～112的9～50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号112同源的碱基为胸腺嘧啶，与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P6)寡核苷酸，其具有与含有序列编号2所示的碱基序列中碱基编号104～119的16～50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，碱基编号119的碱基被G以外的碱基替换，与碱基编号104同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P7)寡核苷酸，其具有与含有序列编号3所示的碱基序列中碱基编号136～145的10～50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号145同源的碱基为胞嘧啶，所述胞嘧啶被荧光色素标记；(P15)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号259～264的6～50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基3’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P16)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号258～262的5～50个碱基长的碱基序列互补的序列或与所述互补的序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261对应的碱基为腺嘌呤或胞嘧啶，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P17)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号249～264的16～50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号261同源的碱基为胸腺嘧啶或鸟嘌呤，位于所述碱基5’侧的胞嘧啶被荧光色素标记；(P18)寡核苷酸，其具有与含有序列编号1所示的碱基序列中碱基编号257～264的8～50个碱基长的碱基序列具有同源性的序列，其中，与碱基编号26本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2010.10.29 JP 2010-2446431.多态性检测用探针，所述探针是能检测EGFR外显子21858多态性的探针，其特征在于所述探针由下述寡核苷酸组成：(P1)由序列编号7的碱基序列构成、且3’末端被荧光染料标记的寡核苷酸。2.如权利要求1所述的探针，其中，所述经荧光标记的寡核苷酸在未杂交靶标序列时发出荧光，并且，与所述靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。3.如权利要求2所述的探针，其中，所述经荧光标记的寡核苷酸在未杂交靶标序列时发出荧光，与所述靶标序列杂交时荧光强度减少。4.如权利要求1～3中任意一项所述的探针，其中，所述探针是用于熔解曲线分析的探针。5.用于检测EGFR基因中多态性的试剂盒，所述试剂盒含有用于检测EGFR外显子21858多态性的权利要求1～4中任意一项所述的探针。6.如权利要求5所述的试剂盒，所述探...

【专利技术属性】
技术研发人员：井口亚希，伊集院萌子，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：