玉米干旱诱导型蛋白基因启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明专利技术提供获得的玉米干旱诱导型蛋白基因LOC100135422启动子序列，包含相对于SEQ?ID?NO：1的转录起始位点的-1bp至-1871bp区的DNA核苷酸序列；还提供用于玉米转化的干旱诱导型蛋白基因LOC100135422的包含玉米干旱诱导型蛋白基因LOC100135422启动子序列和玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC100135422的5′非翻译区的植物表达载体；提供用植物表达载体转化的转基因植物和适于扩增包含SEQ?ID?NO：1序列DNA片段的SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：3的PCR引物。本发明专利技术可用于启动抗旱基因的高效表达，应用于耐旱的转基因植物中，对于解决干旱地区粮食危机、生态恶化等问题均有积极意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物工程
，具体涉及玉米干旱诱导型蛋白基因(L0C100135422)启动子克隆。
技术介绍
干旱生态危机已严重影响到人类的可持续发展，因此在农业生产中，急需耐旱、水分胁迫环境下生长良好的粮食作物和植被。随着现代基因工程技术的迅速发展，植物耐旱已从传统的植物生理研究转向分子方面的研究。作物分子育种技术的采用，使得以基因水平替代原先的染色体组水平进而精细地调节育种成为可能。高等植物基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件，深入研究启动子的结构和功能，建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统，可为功能基因组学研究及通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路。选择适宜的启动子驱动目的基因在转基因植物中表达，已成为植物基因工程研究的热点问题之一。针对不同的目的基因，人们选用不同的启动子，从而使靶基因在特定组织或条件下选择性表达，以利于转基因植物的正常生长发育(赵恢武等，2000 ;刘强等， 2000)。对植物在干旱逆境下大量表达的耐旱基因启动子研究表明，不同耐旱基因的启动子往往含有相同的顺式作用元件，并受相同的反式作用因子的调控。这为我们提供了另外一条研究植物耐旱机制的途径。国内外科学家利用一些耐旱相关的特异性启动子(如RD29A)、特异性蛋白(如脱水素)、耐旱相关的特异性酶(如TPS)基因进行植物遗传转化并获得了成功，得到一些耐旱品质明显提高的转基因植株。清华大学的刘强等(2002)将来自拟南芥的干旱诱导型基因RD29A的两个转录调控因子转入拟南芥后发现拟南芥的干旱耐受性能有很大提高。高世庆(2006)通过基因枪介导转化小麦幼胚愈伤组织，经过分子生物学检测及在PEG胁迫下的 ⑶S组织化学染色证实了 RD29A启动子在小麦愈伤组织中能够诱导⑶S基因的表达。也有科研工作者直接利用干旱诱导型启动子启动某些耐旱有关的蛋白表达进行植物耐旱机理的研究。如利用特异性的启动子启动与耐旱有关的基因(如脱水素基因等)或特异性的渗透调节物合成酶基因在烟草、拟南芥等模式植物体内表达获得耐旱植株；通常情况下在双子叶植物中常用的组成型启动子CaM35S启动海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)在烟草和拟南芥中均获得耐旱植株，而用诱导型启动子RD29启动TSP (海藻糖-6-磷酸合酶)在烟草中表达，获得了较为明显的耐旱烟草植株。单子叶植物的Ubiquitin-promoter由两部分组成exon和intron,其中intron具有增强子的功能。目的基因在其启动下能够大量稳定的在单子叶植物体内表达。浙江大学郝中娜等(2005)对水稻0sWRKY19及0sWRKY89基因的启动子进行功能研究，表明这两个基因的启动子是组织特异性表达的诱导型启动子。Brown 等(2010)首次发现冬小麦bltlOl基因启动子内存在高度保守的TCA-Iike元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi (2003)等分离了小麦低温应答基因家族基因Wcorl5上游的启动子序列证实该启动子受低温和光诱导。利用干旱诱导型启动子驱动抗旱基因的高效表达，从而改良作物的耐旱性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗旱相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种干旱诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目标基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米早期干旱诱导蛋白基因L0C100135422(以下简称L0C)。本专利技术的第二个目的是提供一种用于植物转化的干旱诱导型蛋白基因LOC启动子载体，该载体指导高水平表达目标基因LOC的干旱诱导型蛋白基因LOC启动子序列和5' 非翻译区。本专利技术的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因植物。该转基因植物能反映启动子诱导活性的高低。本专利技术的第四个目的是提供玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC启动子的核心序列。为实现上述目的，本专利技术克隆了玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC的干旱诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有干旱诱导型基因LOC的5'非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米胚中诱导表达，并观察到该启动子与干旱诱导性相关的高水平活性。并用烟草叶盘转化的方法得到转基因烟草，对转基因烟草通过 GUS染色发现，该启动子具有干旱诱导的特性，并通过荧光定量的方法初步确定了该启动子的核心区域。本专利技术提供了一种获得的玉米干旱诱导型蛋白基因LOC启动子序列，该启动子序列包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-1871bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，干旱可以在植物中诱导本专利技术所述的启动子的高水平活性。获得的玉米干旱诱导型蛋白基因LOC启动子序列源自玉米早期干旱诱导蛋白基因 LOC。一种克隆得到的玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC的5'非翻译区包含相对于 SEQ ID NO : I的转录起始位点的+Ibp至+93bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本专利技术所述的非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。为实现另一个目的，本专利技术提供一种用于玉米转化的干旱诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米干旱诱导型蛋白基因LOC启动子序列和玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC的5'非翻译区。上述用于玉米转化的干旱诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA (转移DNA)的RB (右边界序列)和 LB (左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如PCAMBIA1301载体、PBI121 载体。一种用植物表达载体转化的转基因植物，包含玉米干旱诱导型蛋白基因LOC启动子序列和玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC的5'非翻译区。本专利技术提供的SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO: I的序列DNA片段。关于本专利技术所述的用于植物的诱导型载体(PCAMBIA1301)，所述的玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC的启动子和5'非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本专利技术提供通过插入本专利技术所述的玉米早期干旱诱导型蛋白基因LOC的启动子和5'非翻译区至含有⑶S报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述⑶S报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。本专利技术提供一种应用干旱诱导型二元载体的转基因植物，以及一种应用本专利技术所述进行瞬时表达的玉米成熟胚。植物能通过使用例如根癌农杆菌(An, G. 1987, Plant Physiology)或粒子轰击方法(Lacort等，1997,Plant Cell Reports)由上述植物干旱诱导型启动子二元载体进行转化。在本专利技术中，例如烟草可以用叶盘转化法进行转化。本专利技术提供来自玉米的早期干旱诱导型蛋白基因LOC启动子和5'非翻译区，根据本专利技术的启动子和5'非翻译本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘洪玉，胡瑞学，张世宏，刘金亮，贾承国，李桂，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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