温室白粉虱特异性SCAR标记、特异性引物及快速分子鉴定方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体地，涉及温室白粉虱特异性SCAR标记、特异性引物及快速分子鉴定方法。本发明专利技术的温室白粉虱特异性SCAR标记，所述特异性SCAR标记的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术还包括与上述温室白粉虱特异性SCAR标记杂交的探针或与其退火的标记引物对。本发明专利技术的温室白粉虱快速分子鉴定方法，包括使用上述温室白粉虱特异性SCAR标记探针进行杂交或与其退火的特异性引物进行PCR扩增的步骤。本发明专利技术的SCAR分子标记具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点，能够快速准确地鉴定温室白粉虱，且费用低廉。本发明专利技术可快速、廉价地进行田间温室白粉虱的快速识别鉴定，对于其田间的针对性防治具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体地，涉及温室白粉虱特异性SCAR标记、特异性引物及快速分子鉴定方法。
技术介绍
温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)是世界范围的灾害性害虫，已报道的寄主植物超过900种(Kirk等，2000)。其以成虫和若虫吸取寄主植物汁液，使叶片褪色、变黄、萎蔫，能分泌大量蜜露，污染果实和叶片。更为重要的是传播植物病毒病，如黄瓜黄化、 番茄褪绿等，严重时可引起叶片干枯、植株死亡等。20世界70年代中期在我国北方地区爆发，之后一直是我国北方地区的主要害虫(朱国仁等，中国蔬菜，2006 (6) :49-51)。特别是近几十年来，北方地区菜田生态系统发生了深刻变化，特别是加温温室和塑料大棚蔬菜生产的迅速发展，为本种害虫提供了冬季繁衍的良好环境，井形成虫源基地，使得原本在露地不能越冬的害虫有了大发生的可能；温室、大棚和露地蔬菜生产紧密衔接、相互交错，使温室白粉虱种群得以繁衍和周年发生，危害加重，在大型连栋温室果菜上常猖獗成灾。目前温室白粉虱仍是我国北方蔬菜生产的重要限制因子(时玉娟，张明欣，刘加娥，李晓英，2011， 中国果菜，(2) :26-28) ο在我国北方地区，温室白粉虱和烟粉虱寄主重叠、危害习性相似，生活史相近，且同域混合发生，外形相似而难以区分。虽然有文献提出其外部形态或显微镜检识别特征 (朱国仁等，中国蔬菜，2006(6) 49-51 ；褚栋等，昆虫知识，2008，45 (1):巧4_155)，但是这两种害虫的外部形态上的快速区分对于非粉虱研究专业人士来说仍旧比较困难，而且由于粉虱害虫的可塑性強，其形态特征会因环境条件、寄主植物差异等存在不同程度的变异，尤其是对于异地采集保存在酒精中的粉虱害虫或者是保存不完整的标本等，采用上面两种方法根本无法鉴別。而分子鉴定技术相对准确、快速，且对于样品的保存相对简单，与样本的完整与否无关，因此，有必要发展其快速分子鉴定技木。随着分子生物学的发展，近年来分子生物学技术发展迅速，利用分子标记技术只需要少量的DNA就可以快速准确地鉴定出昆虫种类，该类技术不仅可以检测成虫，对其它各虫态亦具有同样的检测效能。以前有研究者采用扩增测序mtCOI序列或者ITS2序列，并与已登录在GenBank上的该基因序列一起构建聚类树，由聚类分析得知分析样本与已知序列之间的亲缘关系远近，进而推断出该基因的所属种类(Hinomoto等，2007 ；Vera等，2007 ； Tselila等，2007)。但是该技术需要标本在PCR扩增之后进行测序，这样会耗费大量的财 カ和劳力。限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，简称 RFLP)和单链构象多态性(Single-Mranded Confirmation Polymorphisms，简称 SSCP) 等技术也通常被用来进行昆虫种类的分子鉴定，但是其过程复杂，需要酶切、扩增或者扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法等，需要花费较长时间，费时费力。还有研究者扩增ITS区域片段结合限制性内切酶位点，酶切之后根据片段的长短来判断种的差异(Jeong等，2010, Molecular identincation οι two trιchogramma species (Hymenoptera Trichogrammatidae) in Korea. Journal ofAsia-Pacific Entomology, 13 :41-44) ,O=Liftft 方法尚需要两个操作步骤，且酶切结果受到多种因素影响而易出现切不开或者由于扩增错配导致的酶切位点改变等现象。特征序列扩增区域(sequence characterized amplified regions, SCAR)标记技术是通过随机扩增多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术筛选出靶标种的特异片段，然后将目标RAPD特异性片段进行克隆和测序， 并根据此目标片段两端的碱基序列设计特异性引物；然后以该对特异性引物对基因组DNA 片段再次进行PCR扩增，进而将与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来；SCAR标记为共显性遗传，待检DNA样品间的差异可通过扩增产物的有和无来显示(黎裕等，1999)。与上述其它分子标记方法相比，具有操作简便、灵敏度高等优点，可用于样品的大规模检测。以往田间与温室白粉虱同时发生的烟粉虱生物型仅为B型，然而目前，国内大多数地区发生危害的烟粉虱的优势生物型发生了变化，演替为Q型烟粉虱(Pan等，2011， Journal ofEconomic Entomology.)。但是，目前还未有能够同时鉴别B型、Q型烟粉虱和温室白粉虱的分子标记。因此，本专利技术通过RAPD扩增，找到温室白粉虱的特异性条带，进而转化为稳定的SCAR标记，来进行温室白粉虱的鉴定识別。使用本专利技术可快速、廉价地进行田间温室白粉虱的快速识别鉴定，对于其田间的针对性防治具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种温室白粉虱特异性SCAR标记。本专利技术的另一目的是提供与上述温室白粉虱特异性SCAR标记部分或完全杂交的探针。本专利技术的另一目的是提供与上述温室白粉虱特异性SCAR标记退火的温室白粉虱特异性SCAR标记引物对。本专利技术的另ー目的是提供ー种温室白粉虱快速分子鉴定方法。本专利技术的另一目的是提供用于鉴定温室白粉虱的试剂盒。本专利技术的另一目的是提供上述温室白粉虱特异性SCAR标记在鉴定温室白粉虱中的应用。本专利技术的另一目的是提供上述探针和引物对在鉴定温室白粉虱中的应用。本专利技术以对多种粉虱的基因组DNA为模板，进行RAPD扩增，获得温室白粉虱的特异性SCAR标记，所述特异性SCAR标记的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示gaccgcttgttgacccacagacagagtagc caggaattcatttttctctctcttttccca60 t ししdcgtgtgtgaaaaagacagat gggggggggagggtatcacgtgactttagc120tcctgtatatctgtcatttcctaacacaga tgatcaaatgggtaatgagagagaaagacg180aactcctggatatagctatatgccgacagc tgtcttaaagtcgttaaggtgaatccgccg240tcgagggaacagttataggtgatttcggaa cagacgttggaatcggaattgggataacaa300tgacccatttcttttggtcacatctttcgt ttgcgtagagatggaggggtccctccaaaa360ctccacaagactcgatcactcaaatcaatc gtttgatgaagcagatttagtcagcgattt420cgcttcaacttttatctaccatcgaagtgc tgctgatcgatttacggttaattactactc480agactatattcctcagagcttctccaaaac aatggacctattgcatgggtctgaaaattg540本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王少丽，王金娜，张友军，吴青君，闫文茜，谢文，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：