具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。相关领域描述纤维素是单糖葡萄糖通过β -1，4_键连接的聚合物。许多微生物产生水解β -连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开(opening it)以受到纤维二糖水解酶攻击 (attack)。纤维二糖水解酶继而从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖的分子。纤维二糖是水溶性的β-1，4-连接的葡萄糖二聚体。葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将含木素纤维素原料(lignocellulosic feedstock)转化为乙醇具有以下优势 大量原料现成可用，避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用于乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。在本领域中，有通过补充其他酶以增加效力而改善纤维素分解蛋白质组合物，和提供划算的供降解木素纤维素的酶溶液的需要。本专利技术提供了具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。专利技术概述本专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，其选自下组(a)多肽，其与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽具有至少90%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在高严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3 的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的成熟多肽编码序列具有至少90%序列同一性；(d) SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体；和(e) (a)、(b)、(c)或(d)的多肽具有纤维二糖水解酶活性的片段。本专利技术还涉及编码本专利技术多肽的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞；和产生所述多肽的方法。本专利技术还涉及降解或转化纤维素材料的方法，包括在本专利技术的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料。本专利技术还涉及产生发酵产物的方法，包括(a)在本专利技术的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。本专利技术还涉及发酵纤维素材料的方法，包括用一种或多种发酵微生物发酵纤维素材料，其中将所述纤维素材料在本专利技术的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化。本专利技术还涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含SEQ ID NO 2的氨基酸1 至17或SEQ ID NO 4的氨基酸1至17，或者所述信号肽由SEQ ID NO 2的氨基酸1至17 或SEQ ID NO 4的氨基酸1至17组成，所述信号肽可操作地连接于编码蛋白的基因；涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并涉及产生蛋白的方法。附图简述附图说明图1显示Thielavia hyraniae NN045097家族6纤维二糖水解酶基因的基因组 DNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO=I和2)。图2显示Thielavia hyraniae NN045178家族6纤维二糖水解酶基因的基因组 DNA序列和推定的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 3和4)。图3显示pCBHII45178的限制图谱。图 4 显示 pGEM-T-CBHII45178 的限制图谱。图5显示pCBHII45097的限制图谱。图 6 显示 pGEM-T-CBHII45097 的限制图谱。图 7 显示在 50°C Thielavia hyraniae NN045097 和 NN045178 纤维二糖水解酶的 PH活性分布(profile)。图 8A 和 8B 显示在 50°C Thielavia hyraniae NN045097 和 NN045178 纤维二糖水解酶的稳定性作为PH的函数。图 9 显示在 pH 5 Thielavia hyraniae NN045097 和 NN045178 纤维二糖水解酶的温度活性分布。图 IOA 和 IOB 显示在 pH 5 Thielavia hyraniae NN045097 和 NN045178 纤维二糖水解酶的稳定性作为温度的函数。定义纤维二糖水解酶术语“纤维二糖水解酶”意指l，4-i3_D-葡聚糖纤维二糖水解酶(l，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation :New insight into the function of ce1lobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15 160-167 ;Teeri 等，1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases :why so efficient on crystalline cellulose ？ , Biochem. Soc. Trans. 26 :173-178)。就本专利技术而言，根据 Lever 等，1972, Anal. Biochem. 47 :273-279 ；van Tilbeurgh 等，1982, FEBS Letters, 149 152-156 ；van Tilbeurgh^PClaeyssens, 1985,FEBS Letters, 187 :283-288 ；以及iTomme等， 1988，Eur. J. Biochem. 170 :575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。可采用Lever 等的方法来评价玉米秸秆中的纤维素水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于确定对荧光二糖衍生物4-甲基伞形基- β -D-乳糖苷G-methylumbelIiferyl-β -D-Iact oside)的纤维二糖水解酶活性。此外，PASC可以用作如本文所述的底物。本专利技术的多肽具有SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4的成熟多肽的至少20%，例如， 至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%和至少100% 的纤维二糖水解酶活性。家族6，GH6或CEL6 术语“家族6”或“GH6，，或“CEL6”在本文中定义为根据 Henrissat B. ，1991， A classification of gly本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晔，汤岚，P哈里斯，吴文平，
申请(专利权)人：诺维信股份有限公司，诺维信公司，
类型：发明
国别省市：