本发明专利技术公开了一种黄芩咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶(CCOMT)基因及其编码的蛋白酶与用途，该基因为首次利用构建全长cDNA文库从黄芩中克隆而得，填补了从我国传统中药材黄芩中分离克隆出咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶基因的空白。本发明专利技术所提供的咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明专利技术提供的咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶基因可以通过生物技术提高黄芩中苯丙氨酸代谢产物的含量，有助于黄芩药材的品质改良，同时可以进行品种选育，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，主要涉及利用全长cDNA文库克隆氧甲基转移酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的酚酸类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
技术介绍
药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。酚酸类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，在药用植物中很多活性成分如丹酚酸、咖啡酸、阿魏酸等均为酚酸类化合物。药用植物黄芩kutellaria baicalensis Georgi为一味常用中药，具有清热燥湿，凉血安胎，解毒功效的功效，是众多复方、保健品的主要成分。黄芩的主要活性成分包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等，其中阿魏酸是由咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶催化形成的，该酶活性的变化也会影响黄芩素、柚皮素等其他活性成分的积累。因此咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)基因的克隆和分析，为用基因工程手段提高黄芩有效部位的含量提供重要基础。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的黄芩酚酸类酶基因及其氨基酸序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)基因。本专利技术第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本专利技术还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。本专利技术的另一个目的在于提供该基因的应用。本专利技术所提供的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCCOMT)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一(I)SEQ ID No. 1 的 DNA 序列；(2)在严格条件下与SEQ ID No. 1的DNA序列杂交且编码具有咖啡酰辅酶 A-3-0-甲基转移酶活性的蛋白质分子的DNA分子；(3)编码SEQ IDNo. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列；(4)编码对SEQ ID No. 2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶活性的蛋白质的核苷酸序列。该基因所编码的蛋白质为黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)，是以下氨基酸序列之一(1)具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID No. 2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶活性的序列。含有本专利技术的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCCOMD)基因全序列或部分序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本专利技术的保护范围。含有本专利技术的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCCOMD)基因全序列或部分序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围。所述宿主细胞为有价值的活体材料。本专利技术的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCCOMD)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。本专利技术技术方案中涉及的概念具体内容如下所说的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)基因的DNA分子包括编码具有黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)基因活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1-818位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1-818的核苷酸序列杂交。所述的序列编码具有SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列的多肽。本专利技术分离出的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)基因多肽包括具有SEQ ID N0. 2 氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。本专利技术中的DNA 分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。本专利技术中术语“黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)”基因指编码具有黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-818位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的编码框第1-818位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0. 1，中第1-818位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0. 2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1-818位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1-818位的核苷酸序列的同源性至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为， 1-90个，较佳地，1-60个，更佳地，1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10 个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。本专利技术中术语“黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)蛋白或多肽”指 具有黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)活性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与天然黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCC0MT2)相同功能的SEQ ID NO. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地 1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和 /或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内) 氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括黄芩咖啡酰辅酶A-3-0-甲基转移酶(SbCCOMD)的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。 本专利技术的丹参黄芩咖啡酰辅酶A-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁媛，黄璐琦，杨兆春，胡国强，秦双双，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：
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