本发明专利技术提供了用于检定α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶活性的方法。在所述检定中，将含有α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶或推测含有α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶的样品与（２Ｒ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ接触。如果α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶存在于所述样品中，则（２Ｒ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ转化成（２Ｓ）－甲基酰基－辅酶Ａ。所述方法然后利用（２Ｓ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ和反式－２，３－脱氢酰基－辅酶Ａ之间的循环反应体系而产生对应于α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶酶活性的可检测信号。也提供了基于相同原理的α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶检定用试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及α-甲基酰基-辅酶A消旋酶检测。特别是，本专利技术提供用于检定样品中的α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法和试剂盒。
技术介绍
α-甲基酰基-辅酶A消旋酶(AMACR)是一种充分表征的酶，其在膳食的支链脂肪酸和C27-胆汁酸中间体的过氧化物酶体β-氧化中起关键作用。Ferdinandusse等，J.Lipid Res.411890-1896(2000)。AMACR催化(R)-α-甲基-支链脂肪酰基-辅酶A酯到它们的(S)-立体异构体的转化。Cuebas等，Biochem.J.363801-807(2002)；Schmitz等，Eur.J.Biochem.231815-822(1995)。将AMACR从人的肝脏作为47-kDa单体分离出并且主要位于过氧化物酶体中，在线粒体中检测到少量。Schmitz等，Eur.J.Biochem.231815-822(1995)；Schmitz等，Eur.J.Biochem.222313-23(1994)。从人的肝脏分离出的AMACR的等电点是pH6.1，并且所述酶在pH7和pH8之间是最佳活性的。已经证明AMACR的升高表达是几种类型癌症的生物标志物，所述癌症诸如前列腺的、结肠直肠的、卵巢的、乳房的、膀胱的、肺的、肾细胞癌、淋巴瘤、和黑素瘤。Rubin等，JAMA 2871662-1670(2002)；Luo等，Cancer Res.622220-2226(2002)；Sreekumar等，J Natl.Cancer Inst.96834-843(2004)。研究也显示α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的酶活性在前列腺的癌症组织样品中升高。Kumar-Sinha等，Am.J.Pathol.164787-93(2004)。PCT WO 02/27324和美国专利公布2002/0123081描述了，通过测量AMACR的表达或活性，用于识别患有发展中的前列腺癌症或处于所述癌症危险中的患者和患有由于前列腺癌症转移至另一个组织而产生的发展中的癌症或处于所述癌症危险中的患者的方法。已经报道了用于检定AMACR的酶活性的数种方法。Schmitz等(Eur.J.Biochem.222313-23(1994))描述了用于AMACR酶活性的辐射测量的检定，其中将2-甲基酰基-辅酶A用作底物。Veldhoven等(Biochem.Biophys.Acta 134762-68(1997))描述了用于AMACR的备选酶检定法，其中将AMACR与2R-甲基-十五烷酰-辅酶A结合。将反应产物，2S-异构体，用过量加入的氧化酶(姥鲛烷酰基辅酶A氧化酶)去饱和，导致过氧化氢的产生，在适合的氢供体的存在下通过过氧化物酶监控。然而，还需要可靠的和灵敏的用于检定样品中AMACR酶活性的方法(例如，用于诊断癌症)。专利技术简述本专利技术提供用于检定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的方法，所述方法包含a)将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A接触而产生(2S)-2-甲基酰基-CoA；b)在(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体存在下，将来自步骤a)的如果产生的(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化成反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A，由此产生第一电子受体的还原形式；在反式-2，3-脱氢-辅酶A转化酶和还原形式的第二电子受体存在下，将所述反式-2，3-脱氢-辅酶A转化回(2S)-2-甲基酰基-辅酶A而形成循环反应体系，由此产生第二电子受体的氧化形式；其中所述第一电子受体和第二是不同的；和c)评定所述循环反应体系中第一电子受体还原或氧化形式或第二电子受体还原或氧化形式的浓度变化，由此确定样品中α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的存在、不存在和/或数量。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-2-甲基-支链的酰基-辅酶A，酰基的链长从C(4)至C(30)，从C((8))至C(25)，或从C(10)至C(25)。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基-辅酶A是(2R)-姥鲛烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，(2R)-2-甲基酰基辅酶A是(25R)-3α，7α，12α-三羟基-5β-胆甾烷酰-辅酶A。在一些实施方案中，首先将(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和氧化形式的第一电子受体加入样品中，并然后将所述样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶、和还原形式的第二电子受体接触。在一些实施方案中，将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、和氧化形式的第一电子受体接触。在其它实施方案中，将推测含有α-甲基酰基-辅酶A消旋酶的样品与(2R)-2-甲基酰基-辅酶A、(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶、氧化形式的第一电子受体、反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶、和氧化形式的第二电子受体接触。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是不同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A脱氢酶，并且第一电子受体选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶是酰基-辅酶A氧化酶，并且第一电子受体是O2。在一些实施方案中，反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶，并且第二电子受体选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶是相同的。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是酰基-辅酶A脱氢酶。在一些实施方案中，(2S)-2-甲基酰基-辅酶A转化酶和反式-2，3-脱氢酰基-辅酶A转化酶都是反式-2-烯酰基-辅酶A还原酶。第一电子受体的氧化形式可以选自由NAD+、NADP+、硫代-NAD+、硫代-NADP+、乙酰基-NAD+、和乙酰基-NADP+组成的组，并且第二电子受体的还原形式可以选自由NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH、乙酰基-NADH、和乙酰基-NADPH组成的组。第一电子受体的还原或氧化形式或者第二电子受体的还原或氧化形式在所述循环反应体系中的浓度变化可以通过光度测量法评定。本专利技术的方法还可以包含将第一电子受体的氧化或还原形式或者第二电子受体的还原或氧化形式偶联到产生颜色的试剂的步骤用于评定所述第一电子受体还原或氧化形式或者第二电子受体还原或氧化形式的浓度变化，其中通过比色法评定第一电子受体的氧化或还原形式或者第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化。可以通过本专利技术的方法检定的样品包括生物样品。在一些实施方案中，所述生物样品是生物流体，诸如血液、血清、血浆、和尿。在一些实施方案中，所述生物样品选自由前列腺、结肠、胎盘、乳房、膀胱、肺、肾、淋巴细胞组成的组。本专利技术的可以用于个体癌症的预后和/或诊断。在一些实施方案本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检定样品中α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶的方法，所述方法包含：ａ）将推测含有α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶的样品与（２Ｒ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ接触以产生（２Ｓ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ；ｂ）在（２Ｓ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ转化酶和氧化形式的第一电子受体存在下，将如果产生的来自步骤ａ）的所述（２Ｓ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ转化成反式－２，３－脱氢酰基－辅酶Ａ，由此产生第一电子受体的还原形式；在反式－２，３－脱氢酰基－辅酶Ａ转化酶和还原形式的第二电子受体存在下，将所述反式－２，３－脱氢酰基－辅酶Ａ转化回（２Ｓ）－２－甲基酰基－辅酶Ａ而形成循环反应体系，由此产生第二电子受体的氧化形式；其中第一电子受体和第二电子受体是不同的；和ｃ）评定所述循环反应体系中第一电子受体的还原或氧化形式或者第二电子受体的还原或氧化形式的浓度变化，由此确定样品中α－甲基酰基－辅酶Ａ消旋酶的存在、不存在和／或数量。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁崇生，
申请(专利权)人：通用原子公司，
类型：发明
国别省市：US[]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。