本发明专利技术公开四个靶向抑制羊痘病毒ORF095基因的siRNA序列，以及这个序列的用途。本发明专利技术的四个靶向抑制羊痘病毒ORF095基因的序列分别是基因序列为SEQ.NO.1的siRNA-61，基因序列为SEQ.NO.2的siRNA-70，基因序列为SEQ.NO.3的siRNA-165，基因序列为：SEQ.NO.4的siRNA-296。本发明专利技术公开的四个靶向抑制羊痘病毒ORF095基因的siRNA序列可在制备抗羊痘病毒的疫苗中的应用，也可在制备抗羊痘病毒的药物中的应用，或者在在培育具有抗羊痘病毒的羊品种中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及四个靶向抑制羊痘病毒0RF095基因的siRNA序列，以及这些序列的用途。
技术介绍
羊痘(Capripox，CP)包括绵羊痘、山羊痘和牛的皮肤疙瘩病，其中前两者是由绵羊痘病毒(She印pox virus, SPPV)和山羊痘病毒(Goatpox virus, GTPV)分别引起绵羊和山羊发生的接触性传染病。病畜体温升高，全身出现丘疹或结节、水疱、内脏病变甚至死亡， 给世界养羊业造成了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其规定为法定必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物传染病。羊痘的预防和控制一直是研究的热点。0RF095是编码病毒粒子包装核心蛋白基因，与猴痘病毒(Monkeypox virus, MYXV)的 M093L 基因(accession no. AF1707^)，以及牛痘病毒(vaccinia virus, VACV) A4L(accession no. M35027)同源。0RF095编码39kDa的酸性蛋白质，是病毒粒子包装核心蛋白基因在病毒粒子感染后的包装和解离过程中合成的主要蛋白质。因此，选择0RF095 基因作为RNA干扰的靶标，将会使病毒复制过程中断，从而达到抑制病毒增值的作用。但目前世界上很少有基于RNA干扰技术靶向羊痘病毒的研究的报道，也没有RNA干扰方法在 0RF095蛋白的研究的报道。与类似方法靶向其他基因实验结果相比发现，0RF095基因作为 RNA干扰靶向的目的基因，以本专利技术设计合成的序列来抑制羊痘病毒复制是一个更为理想的选择。
技术实现思路
本专利技术提供四个人工序列，在相关的实验中这些序列分别表现出对羊痘病毒 0RF095基因具有抑制作用。本专利技术的四个人工序列分别为基因序列siRNA-61 为GTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGACTTGAGGCTGTTGTCATACTT (SEQ. NO. 1)。基因序列siRNA-70为GCTTCTACTTCAAGTTTAATTTCAAGAGAATTAAACTTGAAGTAGAAGCTT(SEQ. N0. 2)。基因序列siRNA-165 为GATGAATCAATTGGAAGAAAATCAAGAGACTTTTACTAGTCATCATGGCTT(SEQ. N0. 3)基因序列siRNA-296 为GCCATGATGAACTAGTAAAAGTTCAAGAGACTTTTACTAGTTCATCATGGCTT(SEQ. N0. 4)。相关的实验表明，本专利技术的序列siRNA-61、siRNA-70、siRNA-165和siRNA-296均可以抑制羊痘病毒0RF095基因的表达。相关的实验提示本专利技术的序列siRNA-61、siRNA-70、siRNA-165和siRNA-296可在制备抗羊痘病毒的疫苗中的应用，也可在制备抗羊痘病毒的药物中的应用。更进一步，本专利技术的序列siRNA-61、siRNA-70、siRNA-165 和 siRNA-296 可在培育具有抗羊痘病毒的羊品种中应用。例如敲除相关的基因以培育对羊痘病毒具有自然抵抗能力的羊的新品种。附图说明图1为载体pEGFP-Nl转染细胞48小时后的表达情况的荧光显微照片，由图可见， 通过荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白表达量很高。图2为载体pEGFP-Nl转染细胞48小时后流式细胞仪检测图，由图可见绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为35. 56%。图3为转染在荧光显微镜采用绿色荧光暗场下的表达情况，此图可看出 PEGFP-0RF095在BHK-21细胞中得到了表达，并且通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达较高。图4为pEGFP-0RF095转染到细胞48小时后流式细胞仪检测图，有图可见绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为14. 78%。图5为共转染pEGFP-0RF095和对照siRNA_C到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。其中左图通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量比转染了 siRNA-61，siRNA-70, siRNA-165 和 siRNA-296 组多。 图6共转染pEGFP-0RF095和对照siRNA_C到细胞48小时后流式细胞仪检测检测图，由图可见绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为14. 65%，表达绿色荧光蛋白的细胞阳性细胞率与图4相当。图7共转染pEGFP-0RF095和siRNA-61到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量明显比没有转染 siRNA-61组而仅转染pEGFP-0RF095组少。图8为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-61到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图，右图可见流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为1.34%，与siRNA 对照组相比，转染siRNA-61组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 90. 9%。图9为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-70到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。由图可见通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量远比仅转染 PEGFP-0RF095 组少。图10为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-70到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图。由图可见流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为0.49%。与siRNA 对照组相比，转染siRNA-70组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 96. 7%。图11为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-165到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。其中左图通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量远比没有 siRNA-165 而仅转染 pEGFP_0RF095 组少。图12为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-165到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图。由图可见，流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为5. 02%。与siRNA 对照组相比，转染siRNA-165组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 66. 0%。图13为共转染pEGFP-0RF095和siRNA-296到细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。其中左图通过荧光显微镜观察到0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量远比没有 siRNA-296 而仅转染 pEGFP_0RF095 组少。图14为共转染pEGFP-0RF095和siRNA_296到细胞48小时后的表达情况流式细胞仪检测图。右图可见，流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为4. M%。与siRNA 对照组相比，转染siRNA-296组的0RF095与绿色荧光蛋白融合表达量下降了 69. 32%。图15为未转染的细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图。由图可见，通过荧光显微镜观察没有荧光。图16为未转染的细胞48小时后的表达情况荧光显微镜检测图，由图可见，流式细胞仪检测到绿色荧光蛋白的表达阳性细胞为0. 09%，小于1 %，说明阴性对照成立。图17为反转录PCR检测SiRNA对0RF095基因RNA水平的抑制情况。其中上图和下图分别为回收细胞提取RNA经反转录后以0RF095为模板和以细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张强，赵志荀，吴国华，颜新敏，李健，朱海霞，崔立凡，高顺平，才学鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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