用于检测疟疾的探针和引物制造技术

本发明专利技术提供了一种通过使用寡核苷酸探针，利用分离自血液样品的核酸检测及量化由恶性疟原虫或间日疟原虫引起的疟疾感染的方法。本发明专利技术使用的检测方法是通过实时PCR。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种检测及量化由恶性疟原虫或间日疟原虫引起的疟疾感染的方法。 该方法通过使用“寡核苷酸”探针，利用了分离自血液样品的核酸。
技术介绍
疟疾仍然是全球公共卫生的紧要问题，每年死亡人数达0. 7-2. 7百万，其中75% 以上为非洲儿童。在过去的35年，疟疾的发病率增长了 2-3倍。目前它影响着300-500 百万人，导致大约1百万人死亡，主要是在非洲。在1955年，世界卫生组织(WHO)开始了一项通过应用氯喹进行临床治疗和应用DDT(二氯二苯三氯乙烷)控制蚊群而根除疟疾的宏大计划。在20世纪60年代后期逐步停止，这项计划虽然在全世界许多国家引起重要且持续的疾病负担的减轻。然而，在许多国家疟疾仍有复发，其主要是由耐药寄生虫的出现和传播导致的。耐杀虫剂蚊子的出现，人口密度的增加(自1963年，世界人口已经翻了一番)， 全球变暖(这使带菌者扩散至以前没有到达的范围)，持续贫穷，政治动荡，以及由于传染性疾病导致的生产力的损失，所有这些因素破坏了治疗和控制疟疾的稳定的公共卫生基础的维持。人类疟疾是一种存在于大多数热带和亚热带生态世界的地方性寄生虫病。疟疾寄生虫属于疟原虫属，能够感染许多脊椎动物宿主，包括多种非人灵长类物种。四种疟原虫属寄生于人类恶性疟原虫(Plasmodium, falciparum)、三日疟原虫(P. malariae)、卵形疟原虫(P. ovale)和间日疟原虫(P. vivax)。其中，恶性疟原虫和间日疟原虫分别与大部分疟疾的发病率和死亡率相关。为了正确地治疗疟疾病人，准确快速地诊断疟疾是必要的。血涂片的显微镜检查是诊断疟疾的“金标准”。该方法灵敏特异，但是费力又费时。由于光学显微镜诊断疟疾在初级卫生保健水平的一些局限性，已经开发了替代方法，比如PCR和快速抗原捕捉试验。专利技术目的本专利技术的目的是提供检测疟疾的探针和引物。本专利技术的另一个目的是提供检测疟疾的PCR反应混合物。本专利技术的另外一个目的是一种检测和量化疟疾感染的方法。本专利技术还有一个目的是提供一种检测疟疾感染的试剂盒。
技术实现思路
因此，本专利技术涉及有SEQ ID No. 1、2、和3的探针；SEQ ID No. 4或10、5、6、7、8和 9的引物；一种用于检测疟疾的PCR反应混合物，所述混合物包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包含SEQ ID No. 1、2和3的组中的探针、及相应的选自包含SEQ ID No. 4或10、 5、6、7、8和9的组中的引物；一种检测和可选地量化疟疾感染的方法，所述方法包含以下步骤a)形成反应混合物，所述反应混合物包含待检测的样品，核酸扩增试剂，选自包含SEQ ID No. 1、2和3的组中的探针，以及相应的选自包含SEQ ID No. 4或10、5、6、7、8和9的组4中的引物，b)对反应混合物进行PCR以获得目标序列拷贝，然后测量增加的荧光信号，以检测疟疾感染，以及c)可选地从检测信号构造标准曲线，以获得拷贝数，从而量化疟疾感染； 一种检测疟疾感染的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID No. 1、2和3单独的或组合的双重标记探针，相应的SEQ ID No. 4或10、5、6、7、8和9单独的或组合的成对引物，及扩增试剂。附图说明图1显示恶性疟原虫标准曲线。图2显示间日疟原虫标准曲线。具体实施例方式本专利技术涉及有SEQ ID No. 1、2和3的探针。在本专利技术的一个实施例中，所述探针是为了检测疟疾。在本专利技术的另一个实施例中，该探针与5'末端含有荧光团及内部区域或3'末端含有猝灭剂的可探测标记结合。在本专利技术的另一个实施例中，该荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物FAM、VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组。在本专利技术的另一个实施例中，猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4 ‘ - (4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明和BHQ染料的组。在本专利技术的另一个实施例中，优选的荧光团是在5'末端的6-羧基荧光素， 优选的猝灭剂是在3'末端的四甲基罗丹明，或位于内部区域或3'末端的黑洞猝灭剂 1 (BHQl)。本专利技术涉及SEQ ID No. 4或10、5、6、7、8和9的引物。在本专利技术的一个实施例中，有SEQ ID No. 4或10、5和6的引物是正义引物，有SEQ ID No. 7、8和9的引物是反义引物。在本专利技术的另一个实施例中，有SEQ ID No. 4或10和7的引物对应于SEQ ID No. 1 的探针，有SEQ ID No. 5和8的引物对应于SEQ ID No. 2的探针，有SEQ ID No. 6和9的引物对应于SEQ ID No. 3的探针。本专利技术涉及一个用于检测疟疾的PCR反应混合物，所述混合物包含待检测的样品、核酸扩增试剂、选自包含SEQ ID No. 1、2和3的组中的探针，及选自包含SEQ ID No. 4 或10、5、6、7、8和9的组中的相应引物。在本专利技术的一个实施例中，有SEQ ID No. 4或10和7的引物对应于SEQ ID No. 1 的探针，有SEQ ID No. 5和8的引物对应于SEQ ID No. 2的探针，有SEQ ID No. 6和9的引物对应于SEQ ID No. 3的探针。在本专利技术的另一个实施例中，疟疾感染是检测选自包含血液、唾液及尿液样品的组。本专利技术涉及一种检测和可选地量化疟疾感染的方法，所述方法包含以下步骤(a)形成反应混合物，所述反应混合物包含待检测的样品，核酸扩增试剂，选自包含SEQ ID No. 1、2和3的组中的探针，以及选自包含SEQID No. 4或10、5、6、7、8和9的组中的相应的引物；(b)对反应混合物进行PCR以获得目标序列的拷贝，然后测量增加的荧光信号，以检测疟疾感染；以及(c)可选地从检测信号构造标准曲线，获得拷贝数，从而量化疟疾感染。在本专利技术的一个实施例中，有SEQ ID No. 4或10、5和6的引物是正义引物，有SEQ ID No. 7、8和9的引物是反义引物。在本专利技术的另一个实施例中，有SEQ ID No. 4或10和7的引物对应于SEQ ID No. 1 的探针，有SEQ ID No. 5和8的引物对应于SEQ ID No. 2的探针，有SEQ ID No. 6和9的引物对应于SEQ ID No. 3的探针。在本专利技术的另一个实施例中，荧光信号由5'末端有荧光团且在内部区域或3' 末端具有猝灭剂的探针产生。在本专利技术的另一个实施例中，该荧光团选自包含荧光素及荧光素衍生物FAM、VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、四甲基罗丹明、6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基罗丹明和花青染料的组。在本专利技术的另一个实施例中，该猝灭剂选自包含四甲基罗丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-马来酰亚胺、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明和BHQ 染料的组。在本专利技术的另一个实施例中，疟疾感染检测选自包括血液、唾液及尿液样品的组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：曼尤拉·贾甘纳特，钱德拉塞克哈尔·布哈斯卡拉恩·奈尔，皮拉里塞蒂·文卡塔·苏巴拉奥，穆拉克卡普斯·纳拉亚南·马诺杰，萨马曼迪里·马坎代亚赫·萨什雷克哈，
申请(专利权)人：彼格泰格私人有限公司，
类型：发明
国别省市：