用于检测乙型肝炎病毒的寡核苷酸探针及引物制造技术

本发明专利技术提供用于检测和量化乙型肝炎病毒的方法。本发明专利技术公开了用于检测乙型肝炎病毒的ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１和２中列出的寡核苷酸探针以及ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．３、４、５和６中列出的各自的引物［正义和反义］。本发明专利技术也提供了用于检测乙型肝炎病毒的ＰＣＲ反应混合物，和用于检测ＨＢＶ的试剂盒，所述试剂盒包括所述混合物以及说明书包装。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测样品中HBV(乙型肝炎病毒)核酸存在和定量的方法。
技术介绍
HBV导致了急性和慢性肝炎(乙型肝炎)，而在严重情况下导致肝硬化和肝癌。近来的研究表明，全世界感染乙型肝炎病毒(HBV)的人数总计达到约300百万。用于直接检测感染主体的血液/血清或血浆中的HBV核酸的基于PCR分析，可以提供测定受感染患者精确病毒载量的优点，这种精确的病毒载量对于医师知晓感染的准确阶段是有用的。这可以进一步帮助医师对患者提供正确的疗法。量化精确的病毒载量也能够有助于监控抗病毒疗法的进展。目前所用的HBV诊断方法是基于ELISA (酶联免疫吸附实验)的，这是基于血清标记物，如HbeAg、HbsAg或抗-HBc IgM、抗-Hbe、抗-HBs或抗-HBc IgG的存在。因为基于ELISA的方法不能提供精确的病毒载量，则需要寻找能够提供定量测定病毒载量的方法。就前述有关已知检测方法的问题而言，还需要有效的方法，才能使其用于检测HBV以能够提供病毒载量的定性和定量测定。
技术实现思路
MM本专利技术的第一个目的是提供一种测定样品中HBV核酸存在的方法。本专利技术的第二个目的是提供用于检测HBV的探针和引物。本专利技术的第三个目的是提供用于检测HBV的PCR反应混合物。本专利技术的第四个目的是提供包含用于检测HBV的探针和引物的试剂盒。因此，本专利技术涉及寡核苷酸探针SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 ；引物SEQ ID No. 3、 4、5和6 ；用于检测乙型肝炎病毒的PCR反应混合物，所述混合物包含核酸扩增试剂、SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中列出的双重标记的探针、引物SEQ ID No. 3、4、5、6和测试样品；检测乙型肝炎病毒的方法，所述方法包含以下步骤形成包含核酸扩增试剂、分别具有对应的引物SEQ ID No. 3和4或SEQ ID No. 5和6的寡核苷酸探针SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2、 测试样品的反应混合物；和将所述反应混合物进行PCR而获得所述靶序列的拷贝接着测定用于检测所述乙型肝炎病毒的荧光信号的增加；以及用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的双重标记的探针，单独地或组合地；对应引物对SEQ ID No. 3、4和5、6，单独地或组合地，以及扩增试剂。附图说明图1是使用商购试剂盒的HBV阳性样品的实时曲线图。图2是使用SEQ ID No. 1的HBV阳性样品的实时曲线图。图3是使用SEQ ID No. 2的HBV阳性样品的实时曲线图。图4是使用SEQ ID No. 1的HBV阴性样品的实时曲线图。图5是使用SEQ ID No. 2的HBV阴性样品的实时曲线图。图6是HBV-标准曲线。具体实施例方式本专利技术涉及寡核苷酸探针SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2。在本专利技术的一个实施方式中，所述探针是双重标记的探针。在本专利技术的一个实施方式中，所述探针检测乙型肝炎病毒。在本专利技术的一个实施方式中，所述探针与在5'端具有荧光团而在内部区域或在 3'端具有淬灭基团的可检测标记结合。在本专利技术的一个实施方式中，所述SEQ ID No. 1被设计针对乙型肝炎病毒的表面基因，而SEQ ID No. 2被设计针对乙型肝炎病毒的X-基因区域。本专利技术涉及引物SEQ ID No. 3、4、5和6。在本专利技术的一个实施方式中，所述引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 5分别是正义的引物，而SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6分别是反义的引物。在本专利技术的一个实施方式中，所述引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4用于SEQ ID No. 1的双重标记的探针，而引物SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6用于SEQ ID No. 2的双重标记的探针。本专利技术涉及用于检测乙型肝炎病毒的PCR反应混合物，所述混合物包含核酸扩增试剂、SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2中列出的双重标记的探针、引物SEQ ID No. 3、4、5、6和测试样品。在本专利技术的一个实施方式中，所述样品选自由血液、血清和血浆组成的组。在本专利技术的一个实施方式中，所述PCR是实时PCR。本专利技术涉及检测乙型肝炎病毒的方法，所述方法包含以下步骤(a)形成包含核酸扩增试剂、分别具有对应的引物SEQ ID No. 3和4或SEQ ID No. 5和6的寡核苷酸探针SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2、测试样品的反应混合物；和(b)将所述反应混合物进行PCR以获得所述靶序列的拷贝，接着测定用于检测所述乙型肝炎病毒的荧光信号的增加。在本专利技术的一个实施方式中，所述探针与在5'端具有荧光团，而在内部区域或在 3'端具有淬灭基团的可检测标记结合。在本专利技术的一个实施方式中，所述引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 5分别是正义的引物，而SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6分别是反义的引物。在本专利技术的一个实施方式中，所述测试样品选自由血液、血清和血浆组成的组。在本专利技术的一个实施方式中，所述扩增试剂包括氯化镁、Taq聚合酶和用于扩增的缓冲液。在本专利技术的一个实施方式中，所述检测本质上是定性或定量的。在本专利技术的一个实施方式中，所述荧光团选自由荧光素及荧光素衍生物FAM、VIC、 J0E、5-(2’ -氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、荧光黄、德克萨斯红、四甲基若丹明、6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、5-羧基若丹明和花青染料组成的组。在本专利技术的一个实施方式中，所述淬灭基团选自由四甲基若丹明、4’ -(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’ -马来酰亚胺、四甲基若丹明、羧基四甲基若丹明和BHQ染料组成的组。在本专利技术的一个实施方式中，所述荧光团优选是在5'端的6-羧基荧光素而所述淬灭基团优选是在3'端的四甲基若丹明或在内部区域或在3'端的黑洞淬灭基团 1_1]。本专利技术涉及用于检测乙型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包含SEQID No. 1和SEQ ID No. 2的双重标记的探针，单独地或组合地；对应引物对SEQ ID No. 3、4和5、6，单独地或组合地；以及扩增试剂。在本专利技术的一个实施方式中，所述扩增试剂包括氯化镁、Taq聚合酶和用于扩增的缓冲液。本专利技术牛物序列的列表SEQ ID No. 1和对应引物3和4具有如下表1中所示的序列标识号表-权利要求1.寡核苷酸探针SEQID No. 1和SEQ ID No. 2。2.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针是双重标记的探针。3.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针检测乙型肝炎病毒。4.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针与在5'端具有荧光团而在内部区域或 3'端具有淬灭基团的可检测标记结合。5.根据权利要求1所述的探针，其中所述SEQID No. 1被设计成针对乙型肝炎病毒的表面基因，而SEQ ID No. 2被设计成针对乙型肝炎病毒的X-基因区域。6.引物SEQ ID No. 3、4、5 和 6。7.根据权利要求6所述的引物，其中所述引物SEQID No. 3和SEQ ID No本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．寡核苷酸探针ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１和ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．２。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：曼尤拉·贾甘纳特，
申请(专利权)人：彼格泰格私人有限公司，
类型：发明
国别省市：IN