本发明专利技术公开了一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，其具有SEQ?IDNO：2所示的氨基酸序列。本发明专利技术还同时公开了编码上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的基因，其具有SEQ?ID?NO：1中第126-290位的核苷酸序列；或者与SEQ?IDNO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者其核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ?ID?NO：1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交。上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽能用于制备蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂，用于转基因作物或改造植物共生菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学、基因工程以及蛋白工程领域。特别是一种在蝶蛹金小蜂毒液中表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白及其编码的核酸序列和应用。
技术介绍
害虫一直严重威胁着全球农作物的安全生产，每年都造成全球粮食产量约1/4的减产，经济损失巨大。在我国，农业害虫也是一直制约农业增产和农产品质量提高的重要制约因素，据统计全国病虫害发生面积年已由2000年的50亿亩/次增加至2009年的70亿亩/次。每年通过防治病虫害挽回的粮食损失约占总产的15%-20%，即便如此，每年粮食损失仍可达300亿 500亿斤。自化学农药DDT问世以来，害虫的防治一直主要依赖化学农药，其后果是出现了害虫再猖獗、害虫产生抗药性、农药中毒、农药残留超标、污染严重等问题。人们一直探索寻找新的有效、安全、低毒的害虫防治方法，随着转基因技术的出现，又提供了一种新思路去解决害虫问题。自20世纪90年代中期以来，抗虫转基因作物培育与应用取得成功，使害虫的有效控制出现了新机。据统计，全球转基因种植面积由1996年的约170万公顷猛增到 2008年的125百万公顷(其中抗虫的有46百万公顷)，增长了 70多倍，其中也产生了明显的经济与生态效应。但是，随着仅有单一 Bt基因抗虫Bt作物的连续种植，靶标害虫对其产生抗性的问题也随之日趋备受关注，且这种担忧已在Bt棉田的美洲棉铃虫H. zea上已出现迹象。为此， 不少学者一方面又再去寻找发现新的Bt抗虫基因，另外还从微生物、植物和动物(主要是蝎子、蜘蛛)中挖掘具有杀虫活性的蛋白/肽基因，通过多基因或融合基因等手段，培育新型抗虫转基因植物，延缓或攻克害虫产生抗性问题。寄生蜂作为一类重要的害虫生物防治作用物，在传统生防中已得到充分肯定，在减少化学农药使用和环境污染方面有着重要作用。寄生蜂能利用自身携带的多种寄生因子(毒液(venom)、多分DNA病毒(polydnavirus， PDV)、类病毒颗粒(virus like particle，VLP)、类病毒纤丝(virus like filament，VLF)、 卵巢蛋白(ovarian protein, OP)、畸形细胞(teratocyte))，以破坏寄主免疫反应、调节寄主生长发育、调控寄主血淋巴营养成分以及扰乱寄主生殖和内分泌系统等以保证其后代在寄主血腔或体表正常发育。若能将寄生蜂的寄生因子结合现代生物技术，可望用于研制新型生防制剂或转基因作物，将为害虫生物防治开辟新的途径。例如，已成功将藏红足侧沟茧蜂(Microplitis croceipes)畸形细胞的分泌蛋白基因转入烟草，并使烟草天蛾(Manduca sexta)生长明显减缓，危害程度明显低于非转基因对照。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种对常见农业害虫具有免疫抑制作用(抑制黑化)的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白基因Pp-PI及其编码的蛋白质。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，其具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。作为本专利技术的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的改进=Pp-PI多肽为多肽、其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。本专利技术还同时提供了编码上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的基因，其特征是其具有SEQ ID NO :1中第126-290位的核苷酸序列；或者与SEQ ID NO: 1中从核苷酸第U6-290位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者其核苷酸序列能在 40-55°C条件下与SEQ ID NO=I中从核苷酸第1沈_290位的核苷酸序列杂交。作为本专利技术的基因的改进序列中包含8 66个连续核苷酸。本专利技术还同时提供了上述蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的用途用于制备蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂，用于转基因作物或改造植物共生菌。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白Pp-PI氨基酸序列及其编码的核酸序列，包括编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ IDNO 1中从核苷酸第 126-290位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55°C条件下与SEQID NO 1中从核苷酸第U6-290位的核苷酸序列杂交。蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽，具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，其保守性变异多肽、其活性片段或其活性衍生物。本专利技术所提供的蝶蛹金小蜂毒液蛋白Pp-PI及其编码的核酸序列，使其能够应用其氨基酸序列、编码序列及其在开发成有应用价值的抗虫作物和农药物并应用于农业害虫防治等多个领域。本专利技术利用反向液相色谱技术分离蝶蛹金小蜂毒液中的活性成分，对各个组分进行活性测定并对其进行N端测序，利用测得的氨基酸序列设计兼并引物PCR扩增获得基因的片段，结合5’-RACE和3’-RACE技术获得目的基因的全长，基因的开放阅读框所推导的氨基酸序列与蛋白N端测序结果完全一致。获得蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI 的氨基酸序列后，对其进行了多肽的化学固相合成及原核表达纯化，化学合成的Pp-PI及表达含GST标签的Pp-PI都能够抑制菜粉蝶(Pieris rapae)蛹及柑橘凤蝶(Papilio xuthus)蛹酚氧化酶前体(PPO)的激活，阻止其形成有活性的酚氧化酶(PO)，具有抑制寄主体液免疫的功能。本专利技术是通过以下技术方案实现的在本专利技术所分离出的DNA分子包括编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQID NO 1中从核苷酸第U6-290位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55摄氏度条件下与SEQ ID NO :1中从核苷酸第126-290位的核苷酸序列杂交。较佳的，所述的序列编码具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO 1中从核苷酸第U6-290位的核苷酸序列。本专利技术分离出的蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI包括具有SEQ IDNO :2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO 2序列的多肽。本专利技术DNA分子包含所述的DNA分子中8_66个连续核苷酸。本专利技术DNA分子转化的宿主细胞是原核细胞。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的，，DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA片段已经与天然状态下伴随核苷酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂多肽Pp-PI编码的核酸序列指编码具有蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Pp-PI活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ IDNO :1中第126-290位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0:1序列编码框第657-722位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子取代后产生的序列。由于密码的简并性，所以与SEQ IDNO :1中第126-290位核苷酸序列同本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．蝶蛹金小蜂毒液丝氨酸蛋白酶抑制剂Ｐｐ－ＰＩ多肽，其特征是：具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶恭银，王磊，方琦，王飞，朱洋铿，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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