修饰的胱抑蛋白Ａ支架蛋白制造技术

本发明专利技术提供用于展示肽如肽适体的新型支架蛋白。该新型支架蛋白是胱抑蛋白Ａ或ＳＴＭ（胱抑蛋白Ａ的一种变体）的修饰形式，可用作支架蛋白和展示系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的胱抑蛋白A支架蛋白本专利技术涉及用于展示肽，如肽适体的新型支架蛋白。具体说，本专利技术涉及修饰的胱抑蛋白A多肽和修饰的基于胱抑蛋白A(StefinA)的人工蛋白用作支架蛋白和展示系统的应用。
技术介绍
研究蛋白质相互作用对于理解许多生物学过程，如基因产物在健康和患病个体体内的作用而言至关重要。具体说，肽适体已经成为分子医学的基本理论和应用研究中使用的重要的分子工具。由于它们能够在胞内水平特异性结合给定的靶蛋白并使其失活，它们提供了一种在体外和体内进行功能性蛋白质分析的实验方案。它们也可用于胞外蛋白质。关于在研究蛋白质功能的应用，这些工具可用于分子检测、诊断和/或用作治疗剂。肽和肽适体可以溶液游离形式使用。然而，不受限制的小肽容易形成呈现受限的相互作用表面的结构。而且，它们与靶分子结合后，常常发生构象熵降低，结合自由能降低，最终游离肽常常不形成紧密的非共价复合物，这是个难题。此外，在细胞内肽快速降解，这限制了它们在研究蛋白质体内相互作用中的有效性，这也是个难题。除了以游离溶液使用之外，感兴趣的肽还可结合于物理支持物，或展示于较大的多肽中。前者不容易应用于体内研究。而在后一种情况中，通过遗传方法将肽插入简单稳定的支架蛋白的一级序列中。支架的折叠在构象上限制了肽，因此肽适体以高特异性和高亲和力结合其结合伙伴。在多肽中展示在本专利技术中非常重要。这种展示常常是用支架蛋白进行的。现有技术支架包含灭活的葡萄球菌核酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)和硫氧还蛋白A(TrxA)，以及分离的蛋白质折叠，如葡萄球菌蛋白A的Z结构域、“亲和蛋白(affibody)”、抗脂质运载蛋白(anticalin)和锚蛋白重复。现有技术中的支架蛋白还包括III型纤连蛋白结构域(′Fn3′)、产生抗脂质运载蛋白的脂质运载蛋白家族蛋白质、后胆色素结合蛋白(BBP)等。近期，WO2006/131749记载了在胱抑蛋白A中产生若干合理突变，以改进其作为支架的性能。修饰的胱抑蛋白A支架在以下三个位点包含突变：Lys71-Leu73、V48D和G4W，其称为STM(胱抑蛋白A三突变体)。已证明，这三个突变的组合产生的蛋白质与人细胞蛋白质的相互作用最少，具体说，已经无法检测到这种蛋白质与其已知天然结合伙伴的相互作用。然而，我们发现将肽插入该蛋白的71-73位会产生在插入肽末端对该蛋白的截短强烈的选择压力。虽然这种截短的蛋白质可展示生物学功效，但观察结果导致以下担忧：简单地插入71-73位而不引起截短的一小组肽可能不能与靶蛋白自由地相互作用，这是个难题。而且，在单一位置上插入肽不可避免地限制了用于蛋白质相互作用的总表面积，进而限制结合亲和力，也可能限制特异性。如本专利技术所述，对胱抑蛋白A和修饰的基于胱抑蛋白A的人工蛋白如STM(胱抑蛋白A三突变体)进行的新型突变提供了可替代的改进且更稳定的支架蛋白，也提供比现有技术更佳多样化的展示系统。而且，也不大可能预计到这些新型蛋白质支架/展示系统作为高效的展示实体。已经在胱抑蛋白A/STM蛋白中特定的不同区域上产生下文所述的新突变，令人惊讶地发现它们不影响胱抑蛋白A/STM蛋白的构型或它们作为支架蛋白的潜在功能。而且，通过进一步工程改造，可以用本专利技术的改进支架提供修饰，其中该支架具有多个至今现有技术中不可能实现的插入。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供修饰的胱抑蛋白A多肽或修饰的STM蛋白，其中该修饰包含在选自下组的位点插入的单个突变或异源寡核苷酸编码的肽：(i)密码子4上的突变，其中胱抑蛋白A的甘氨酸或STM的色氨酸被另一氨基酸或异源寡核苷酸编码的肽替代，所述另一氨基酸对于胱抑蛋白A不是色氨酸或对于STM不是甘氨酸；或者(ii)在编码包含或限定环1的氨基酸的密码子46-54中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入；或者(iii)在编码包含或限定环2的氨基酸的密码子67-84中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入。在本申请的说明书和权利要求书中，术语“包含”、“含有”和这些术语的变化形式，例如“包含着”和“包含了”的含义是“包括但不限于”，它们不旨在(且不会)排除其它部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本申请的说明书和权利要求书中，除非另有说明，单数形式也包括复数含义。具体说，使用不定冠词时，应理解为考虑到复数和单数含义，除非另有说明。应理解，除出现不相容的情况以外，在本专利技术的特定方面、实施方式或实施例中描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团也可应用于本文所述的任何其它方面、实施方式或实施例。本文提到支架蛋白时，指融合成一个蛋白质的序列，该术语也与融合蛋白同义。“融合蛋白”指包含与一种或多种不同(即“异源”)肽或蛋白质结合的本专利技术支架蛋白的蛋白质。插入异源肽或蛋白质使该融合蛋白能够结合所需的靶点。本专利技术基于新的修饰，包括插入野生型胱抑蛋白A蛋白质本身(胱抑蛋白A优选是人胱抑蛋白A)或者插入其三突变体STM，使它们成为适合用作稳定的支架蛋白的形式；而伴随的有利情况是，通过突变与组织蛋白酶或其它未知蛋白发生天然相互作用所需的残基消除生物学显著的相互作用和活性，从而使它们呈生物中性。而且，应考虑到所选的突变或插入位点能够接受和限制插入的肽产生(例如)肽适体。尽管人体研究可能需要人支架，但使用(例如)小鼠胱抑蛋白A在小鼠生物和/或疾病模型中进行研究可能有利，类似地，衍生自其它物种或植物的胱抑蛋白A也可用于该特定物种中。因此，本专利技术的支架和展示系统可用于任何所选的物种，胱抑蛋白A的产生依赖于使用者的要求。应理解，编码胱抑蛋白A或其STM形式的密码子4的氨基酸的DNA序列中的改变，或者编码包含或限定胱抑蛋白A或其STM形式的环1的氨基酸的密码子46-54中的改变，或者编码包含或限定胱抑蛋白A或其STM形式的环2的氨基酸的密码子67-84中的改变可以相互独立。也就是说，对胱抑蛋白A蛋白质的修饰可以在三个不同的独立区域之一中进行，即在4位中或者在限定环1或环2中。相似地，对三突变体形式STM的修饰也可在三个特定的独立位点之一中进行，即在4位中或者在限定环1或环2中。胱抑蛋白A或STM的其余序列不变，它们包括下述序列。野生型人胱抑蛋白A的序列见下(SEQIDNO：1)：MIPGGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVVAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFKSLPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF三突变体STM的序列见下(SEQIDNO：2)，用粗体和下划线标出STM与野生型胱抑蛋白A不同的突变位点：MIPGLSEAKPATPEIQEIVDKVKPQLEEKTNETYGKLEAVQYKTQVAGTNYYIKVRAGDNKYMHLKVFPGQNEDLVLTGYQVDKNKDDELTGF本文所用术语“突变”指遗传物质中的永久性改变，突变可能是氨基酸残基的加入、缺失、插入或取代。优选地，在单个突变是胱抑蛋白A密码子4的甘氨酸的实施方式中，其取代选自下组：G4V、G4I、G4L、G4M、G4F、G4P、G4N、G4V、G4Q、G4S、G4T、G4W、G4Y、G4R、G4H、G4K、G4D和G4E。更优选地，该改变是G4R，也就是说，密码子4中的甘氨酸被精氨酸取代。优选地，在单个突本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的胱抑蛋白Ａ多肽或修饰的ＳＴＭ蛋白，其中所述修饰包含在选自下组的位点插入的单个突变或异源寡核苷酸编码的肽：　　（ｉ）密码子４上的突变，其中胱抑蛋白Ａ的甘氨酸或ＳＴＭ的色氨酸被另一氨基酸或异源寡核苷酸编码的肽替代，所述另一氨基酸对于胱抑蛋白Ａ不是色氨酸或对于ＳＴＭ不是甘氨酸；或者　　（ｉｉ）在编码包含或限定环１的氨基酸的密码子４６－５４中的任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入；或者　　（ｉｉｉ）在编码包含或限定环２的氨基酸的密码子６７－８４中任何改变或异源寡核苷酸编码的肽插入。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2008-4-18 0807065.81.一种胱抑蛋白A多肽，该多肽由SEQIDNO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25和异源肽组成，其中，所述SEQIDNO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25在位置4具有突变，其中，所述突变是用精氨酸取代残基4，且：a)所述异源肽在SEQIDNO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25的位置4插入；或b)所述异源肽在位置48-50插入；或c)所述异源肽在位置71-73插入；或d)所述异源肽在位置82/83插入。2.如权利要求1所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(a)、(b)、(c)和(d)的至少两个位置插入。3.如权利要求2所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(a)、(b)、(c)和(d)的至少三个位置插入。4.如权利要求3所述的胱抑蛋白A多肽，其特征在于，所述多肽含有另一异源肽插入，这样至少一异源肽在选自(a)、(b)、(c)和(d)的全部四个位置插入。5.如权利要求1－4中任一项所述的多肽，其特征在于，(a)所述的异源肽在接近胱抑蛋白A的G4位点的位置插入。6.一种胱抑蛋白A多肽，该多肽由SEQIDNO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25和异源肽组成，其中，所述SEQIDNO:1、2、10、13、16、17、22、23、24或25在位置4具有突变，其中，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：P哥费林诺，E让德拉，
申请(专利权)人：利兹大学，医疗研究局，
类型：发明
国别省市：GB