抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一株保藏编号为：CCTCC?No.C201116的分泌抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、一种由杂交瘤细胞株分泌的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是博尔纳病病毒核蛋白，该蛋白的序列为SEQIDNO1，分子量为40KD；还涉及所述抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体的制备方法,及抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体在制备用于检测博尔纳病病毒的抗体检测试剂的应用，所述检测包括免疫印迹法、间接免疫荧光法和间接ELISA法。本发明专利技术提供的抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的特异性好，效价高，制备方法简便易行。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单克隆抗体，尤其涉及了一种抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体， 还涉及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在博尔纳病病毒诊断或检测中的应用。属于免疫学和分子病毒学的交叉

技术介绍
博尔纳病病毒(Borna disease virus，BDV)是一种具有高度嗜神经性的病毒，宿主几乎涵盖了所有的温血动物。被感染宿主表现出以明显精神、行为异常为特征的神经精神性症状，这与某些人类精神障碍的症状极为相似。美国、英国和日本等地的调查显示，在精神分裂症、抑郁症、双相情感障碍等疾病患者外周血液中可以检测出BDV相关抗原，BDV 可能与这些神经递质功能异常的疾病存在某种联系。如果能够确认人类的神经精神性疾病与BDV有关，将会极大地帮助人们防治这类危害越来越大的疾病。但BDV对人体的感染致病性还存在很多疑问，需要进一步加以研究证实。由于该病毒对宿主处于持续慢性感染，复制程度低，检测病毒是否存在感染较为困难。因此需要建立高效灵敏和准确的检测技术对 BDV进行更加全面的研究。血清免疫学检测法是利用抗原和抗体之间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对血清中的抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。其中酶联免疫吸附分析法(ELISA)是最常见的测定方法，具有简单、快捷、灵敏等优点，在BDV流行病学检测和临床研究中已经作为一种重要手段，同时也可以结合核酸检测来增大诊断的准确率。BDV是一种非分节段的单股负链RNA病毒，基因序列总长8. 9 1Λ，基因组开放式读码框(ORF)共编码6种蛋白；其中ORF I编码核蛋白(p40)，ORF II编码磷蛋白(pM)。BDV 核蛋白在被感染的细胞中含量最丰富、变异程度最小，是进行血清学诊断的主要依据。国内曾有使用ELISA方法检测某些患者血清中的BDV磷蛋白抗体(杨爱英，张凤民，李均辉， 等.用蛋白印迹试验检测精神分裂症患者血清中博尔纳病毒病毒-PM抗体的研究.中华实验和临床病毒学杂志，2003，17(1): 85-87;李永杰，王得新，张凤民，等.中国慢性疲劳综合征患者血浆中BDV-pM抗体的检测.中华实验和临床病毒学杂志，2003， 17(4): 330-333)，但目前尚无制备BDV核蛋白单克隆抗体以及相关ELISA检测的报道，由于单克隆抗体的高特异性，使在检测样本中的抗原或循环免疫复合物时具有更高的准确性和可靠性。此外该单克隆抗体尚可用于免疫组化、免疫荧光和动物实验等研究，因此研发 BDV核蛋白单克隆抗体和相关的应用技术是相当必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体及其制备方法。本专利技术还提供了生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其名称为2F6E8，微生物保藏编号为 CCTCC C201116，保藏日期为2011年4月12日。本专利技术利用博尔纳病病毒(BDV)重组核蛋白为免疫原，经过小鼠免疫、常规细胞3融合、筛选及克隆化，建立了稳定分泌抗BDV核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F6E8克隆株)。经ELISA、免疫印迹等方法的鉴定，杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能特异性地识别BDV核蛋白(序列为SEQ ID NOl )。的成功制备，为深入研究BDV感染的机制以及相关疾病诊断、治疗奠定了基础，因此本专利技术还包括所述抗BDV核蛋白的单克隆抗体在制备用于检测博尔纳病病毒的抗体检测试剂的应用。所述检测包括免疫印迹法、间接免疫荧光法和间接ELISA法。所述应用包括(1)该抗体作为试剂盒可以测定各种体液如血液、血浆、脑脊液中BDV感染的水平。(2)利用该抗体，免疫学方法检测各种组织、细胞中的BDV感染的情况。(3)利用该抗体制备免疫亲和层析柱，来分离BDV核蛋白。本专利技术的优点在于(1)本专利技术提供的抗BDV核蛋白单克隆抗体的特异性好，效价高；制备方法简便易行(2)本专利技术提供的抗BDV核蛋白单克隆抗体可用于BDV的诊断和检测。附图说明图IA间接免疫荧光实验检测核蛋白在BDV感染的OL细胞中的表达； 图IB间接免疫荧光实验检测核蛋白在正常OL细胞中的表达；图2 Western-Blot实验检测抗BDV核蛋白单克隆抗体与重组核蛋白和天然核蛋白的特异性反应，其中泳道1为重组核蛋白+抗BDV核蛋白单克隆抗体，泳道2为BDV感染的 OL细胞+抗BDV核蛋白单克隆抗体，泳道3为正常OL细胞+抗BDV核蛋白单克隆抗体，泳道4为BDV重组磷蛋白+抗BDV核蛋白单克隆抗体。具体实施例方式实施例1 :BDV重组核蛋白的制备将p40重组原核表达载体pQE30-p40转化至感受态BL21大肠杆菌中，涂板37°C恒温箱过夜培养，次日挑取单个菌落接种至5mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37°C恒温摇床过夜培养。再取菌液2mL接种至200mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37°C恒温摇床震荡培养2 池直至测菌液OD6tltl值为0. 6，加入终浓度为lmmol/L的IPTG进行诱导，继续37°C 震荡培养4h，离心后弃上清收集菌体。用20ml缓冲液(50mm/L Tris-Hcl)悬浮菌体，在冰浴下超声裂解直至菌液清亮，离心，使用孔径为0. 45 μ m的滤膜对上清进行过滤。用平衡缓冲液平衡HisTrap 纯化柱，然后将过滤后的上清液过纯化柱进行亲和层析纯化，取含20mM TriS-Hcl、50mM咪唑和500mM Nacl的洗涤缓冲液洗去未结合的杂蛋白，然后再洗脱得到纯化的重组核蛋白。进行SDS-PAGE电泳分析蛋白表达形式和纯化效果，将剩余蛋白置-20°C 保存。实施例2 杂交瘤细胞系的建立步骤1、动物免疫取6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫前，尾静脉采血分离血清用作阴性对照，免疫程序如表1所示。表1免疫流程权利要求1.一株由中国典型培养物保藏中心保藏的分泌抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其名称为2F6E8，微生物保藏编号为CCTCC C201116，保藏日期为2011年 4月12日。2.一种抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌。3.根据权利要求2所述的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是博尔纳病病毒核蛋白，该蛋白的序列为SEQ ID NOl，分子量为40KD。4.一种制备抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体的方法，其特征在于所述的方法是从以制备博尔纳病病毒分子量为40KD的重组核蛋白为抗原开始，采用免疫学方法产生融合的杂交瘤细胞；再采用免疫学的检测筛选方法，筛选出抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体。5.根据权利要求2或3所述的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体在制备用于检测博尔纳病病毒的抗体检测试剂的应用，所述检测包括免疫印迹法、间接免疫荧光法和间接 ELISA 法。全文摘要本专利技术涉及一株保藏编号为CCTCC No.C201116的分泌抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、一种由杂交瘤细胞株分泌的抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体所对应的发生特异性结合的抗原是博尔纳病病毒核蛋白，该蛋白的序列为SEQIDNO1，分子量为40KD；还涉及所述抗博尔纳病病毒核蛋白的单克隆抗体的制备方法,及抗博尔纳病病本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　一株由中国典型培养物保藏中心保藏的分泌抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其名称为２Ｆ６Ｅ８，微生物保藏编号为：ＣＣＴＣＣ　Ｃ２０１１１６，保藏日期为：２０１１年４月１２日。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢鹏，徐晓艳，金戈，张亮，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85