杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了杂交瘤细胞株2C9、其分泌产生的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及其应用。杂交瘤细胞株2C9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO.C201018。该杂交瘤细胞株2C9可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，采用鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得的效价可达4.26×106。该抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC50为67pg/ml，与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2交叉反应率均小于0.1%，可用于黄曲霉毒素M1的快速测定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体及其应用。
技术介绍
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素Bl的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。黄曲霉毒素Ml (AFMl)是AFBl的羟基化代谢产物，哺乳动物摄入AFBl污染的饲料后，在体内经羟基化会分泌于乳汁当中。通常当动物摄入了 AFBl污染的食物后，AFMl的排出量为AFBl摄入量的1% 3%。大量的研究者对AFMl的毒性和致癌性进行了深入的研究，研究结果也促使国际癌症研究机构将AFMl的致癌等级由二类致癌物质变为一类致癌物质。AFMl性质稳定，即使经过巴氏杀菌，也几乎完全不能被破坏。在许多乳制品中均含有AFM1。由于乳制品是婴幼儿食物的主要来源，因此AFMl污染问题引起了世界各国的广泛关注，并对AFMl进行了严格的限量。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，因此加强乳及乳制品中黄曲霉毒素Ml的检测、特别是速测，及时了解和掌握乳及乳制品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。 其中薄层层析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、 成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素Ml的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素Ml的抗体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株2C9、其产生的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体及其应用。本专利技术提供了杂交瘤细胞株2C9，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201018。其具有序列表中SEQ Gene No. 1所示的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ Gene No. 2所示的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO. C201018的杂交瘤细胞株2C9分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ Protein No. 1所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ Protein No. 2所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素Ml，对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC5tl为67 pg/mL。 抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体在黄曲霉毒素Ml测定中的应用。本专利技术提供的杂交瘤细胞株2C9是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为将 BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA免疫4_6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素而不抗载体蛋白 BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素Ml作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆， 克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株2C9。本专利技术提供的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体的制备方法，步骤如下将获得的杂交瘤细胞株2C9注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化即得抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体。按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为用双层滤纸过滤小鼠腹水，4°c，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30 35 μ L，室温混合30 60min，4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0. lmol/L和pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液，用2 11101/1的氢氧化钠溶液调节该混合液的？!1值至7.4，4 °C预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0. 277g/mL, 4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min 以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的O.Olmol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，将抗体置-20°C冰箱中备用；所述的醋酸盐缓冲液为0. 29g醋酸钠，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的 0. lmol/L的磷酸盐缓冲液为0. Sg氯化钠，0. 29g十二水磷酸氢二钠，0. 02g氯化钾，磷酸二氢钾0. 02g，加水定容至IOOmL所得。本专利技术的有益效果在于(1)本专利技术提供的杂交瘤细胞株2C9可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体，抗黄曲霉毒素Ml鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达4. 26X 106。(2)本专利技术提供的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素Ml的50%抑制浓度IC5tl为67 pg/mL，与黄曲霉毒素Bi，B2, Gl, G2交叉反应率均小于 0. 1%。(3)本专利技术提供的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体可应用于测定黄曲霉毒素Ml。 附图说明图1为本专利技术的快速检测黄曲霉毒素Ml的免疫层析试纸的正视图。图中1纸板、2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线。图2为本专利技术的快速检测黄曲霉毒素Ml的免疫层析试纸的左视图。图中1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫。图3为实施例4中应用本专利技术提供的抗黄曲霉毒素Ml单克隆抗体制备的试纸条检测样品的结果判定图。图中1对照试纸条；2检测试纸条；3质控线；4检测线。具体实施例方式实施例1 杂交瘤细胞株2C9的制备 1.动物免疫购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的黄曲霉毒素Ml完全抗原AFM1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素Ml完全抗原与等量福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。 第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等量黄曲霉毒素Ml完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．杂交瘤细胞株２Ｃ９，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为ＣＣＴＣＣ　ＮＯ．　Ｃ２０１０１８。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，管笛，李鑫，张奇，张文，丁小霞，姜俊，陈小媚，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83