本发明专利技术公开了一种hIL-17RD-ECD单克隆抗体的制备及应用。本发明专利技术提供的一种保藏号为CGMCC?No.4576的小鼠杂交瘤细胞(mus?musculus?hybridoma)1F8。还提供了小鼠杂交瘤细胞(mus?musculus?hybridoma)1F8产生的单克隆抗体。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术筛选得到1株小鼠杂交瘤细胞(mus?musculushybridoma)1F8，并对其进行生物学特性鉴定，以期进一步探讨hIL-17RD基因与自身免疫疾病如类风湿性关节炎之间可能存在的相互关系及其功能的深入研究提供依据和奠定基础，制备抑制类风湿关节炎等自身免疫疾病的潜在药物蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单克隆抗体的制备和应用，尤其涉及一种hIL-17RD-E⑶单克隆抗体的制备及应用。
技术介绍
Thl7细胞分泌的IL-17包括IL-17A和IL-17F这两个炎症分子，他们都是通过 IL-17受体家族传递信号，从而影响下游基因表达的。白介素17受体家族(IL-17reC印tor) 是一种广泛存在于免疫活性细胞上的免疫性受体，能介导IL-17信号通路，具有很多重要的生理功能。目前已经发现了小鼠和人IL-17RD可以传递IL-17信号传导，并和IL-17RA 形成杂合二聚体。目前，对IL-17RA在基因克隆，蛋白表达等方面都进行了大量的研究，并取得了很大进展，而对IL-17RD的研究相对较少。IL-17RD在一次大规模的原位杂交中被发现，而此次原位杂交旨在筛选出在斑马鱼胚胎发育过程中空间限制基因。这些在类似的空间和时间表达的基因形成一个相互调控在共同通路中相互作用的家族。IL-17RD表达模式与成纤维细胞生长因子基因家族相似，而其表达也是受到FGFs调控的。自从IL-17RD首次从斑马鱼中被发现以来，在鸡，鼠，人类中其直系统同源都被鉴定出来。IL-17RD基因只存在于脊椎动物中，定位于单一的基因座。然而，通过可变联结机制形成了 IL-17RD异构体具有不同的生物化学和生物学特性。因此，进一步对IL-17RD的活性和作用机制的研究称为热点。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞 (musmusculus hybridoma)1F8。本专利技术提供了一种保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞(mus musculushybridoma)1F8。本专利技术另一个目的是提供由保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞 (musmusculus hybridoma) 1F8 产生的单克隆抗体。本专利技术提供了由保藏号为CGMCC No. 4576的小鼠杂交瘤细胞(mus musculushybridoma) 1F8产生的单克隆抗体。所述的单克隆抗体在制备白介素17受体D检测试剂盒中的应用也是本专利技术保护的范围。所述的单克隆抗体在制备检测白介素17受体D的胶体金快速检测试纸条中的应用也是本专利技术保护的范围。含有所述的单克隆抗体的检测白介素17受体D的试剂盒也是本专利技术保护的范围。含有所述的单克隆抗体的检测白介素17受体D的胶体金快速检测试纸条也是本专利技术保护的范围。经筛选得到能稳定分泌抗人白介素17受体D(hIL_17RD)的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F8，该杂交瘤细胞株1F8的分类命名为小鼠杂交瘤细胞mus musculushybridoma, 已于2011年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号为 CGMCC No. 4576。本专利技术的实验证明，本专利技术筛选得到1株能稳定分泌抗人白介素17受体 D(hIL-17RD)的单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对其进行生物学特性鉴定，以期进一步探讨 hIL-17RD基因与自身免疫疾病如类风湿性关节炎之间可能存在的相互关系及其功能的深入研究提供依据和奠定基础，制备抑制类风湿关节炎等自身免疫疾病的潜在药物蛋白。附图说明图 1 为 hIL-17RD-ECD 蛋白的 SDS-PAGE 分析图2为阳性杂交瘤细胞特异性筛选图3为抗hIL_17RD的单克隆抗体的类型鉴定图4为腹水抗体效价的测定图5为单抗纯度及分子质量鉴定图6为Western blot检测内源hIL_17RD的结果图 7 为 Western blot 检测外源的 hIL_17RD 和 hIL_17RD_ECD具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、单克隆抗体的制备1、动物免疫人工合成hIL_17RD的胞外区蛋白(hIL_17RD_ECD，其核苷酸序列为序列表中的序列1所示，其氨基酸序列为序列表中的序列2所示，与GenbankNM_017563. 3的第1-739位核苷酸一致)的核苷酸序列作为模板，以IL-17RD-F_BamHI :atgcggatcccgccgacacctgtggc和 IL-17RD-R-PstI :aactgcagtcagtgatggtgatg 为引物，进行 PCR 扩增，得到的 PCR 产物经过 BamHI和I3StI酶切，与经过同样酶切的PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR载体(购自hvitrogen 产品目录10712024)大片段连接，得到连接产物，转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，转染步骤如下a、挑白斑提取转化子的质粒；b、转染在直径8cm的dish里均勻的铺(2. 5-3) X IO6个sf9细胞(购自武汉病毒所，sf9 cell)，细胞融合度为70%-80%。准备两个2ml的EP管，各加入IOOul的sf900 无血清培养基(Invitrogen，产品目录#10902096)，向其中一管中加入15ulCellfectin (转染试剂，购自hvitrogen，货号G4B2996936FB53)，另一管中加入2mg质粒，轻轻混勻，室温 (250C )静置5min然后将两管混在一起，室温(25°C )静置30min。加1. 8ml sf900培养基轻柔混勻，滴加在铺好的细胞表面，培养箱中静置证。在证后细胞基本贴壁，吸出培养基， 加入8ml新的无血清sf900。27°C静置培养10天，离心留上清，即为PO病毒。4C、病毒扩增取50ul PO加入到50ml密度为(1. 5-2. 5) XlO6的sf9细胞中， 270C IOOrpm培养6天，离心收上清，即为Pl病毒，此时病毒滴度已可以感染细胞并大量表达蛋白。d、感染并表达蛋白用大的细胞培养瓶培养800ml sf9细胞，当细胞密度为 (1. 5-2. 5) X IO6且状态良好时，以1 100加入Pl病毒，27°C IOOrpm培养48-72h，收细胞。e、蛋白纯化将细胞培养物4000rpm离心lOmin，上清抽滤后浓缩，在此过程中换用 lysis buffer (IOmM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.5)浓缩到 200ml，离心 15000rpm35min, 收集上清加入1.5ml Ni-NTA，4°C摇动孵育池，使目标蛋白与Ni-NTA充分结合。孵育后， 使清液流过，加入含20mM咪唑的lysis buffer洗800ml，用15ml含500mM咪唑的lysis buffer洗脱目的蛋白，浓缩至800ul，使用AKTA和Superdex200分子筛层析柱(GE公司产品目录G4A90FD2ACFF64)进行进一步精细纯化，纯化后SDS-PAGE检测结果如图1所示，可以看出该蛋白大小为35KDa左右，即得到目的蛋白hIL-17RA-ECD(hIL-17RD胞外区蛋白；外源 hIL-17RD-ECD)。选6只8-12周龄Balb/C小鼠进行腹腔内免疫，初次免疫用80ug hIL_17RD胞外区蛋白加弗氏完全佐剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５７６的小鼠杂交瘤细胞（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）１Ｆ８。
【技术特征摘要】
1.保藏号为CGMCC No. 4576 的小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma) 1F8。2.由保藏号为CGMCCNo. 4576的小鼠杂交瘤细胞(mus musculus hybridoma) 1F8产生的单克隆抗体。3.权利要求2所述的单克隆抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：常智杰，孙小军，杨世高，王银银，任芳丽，夏永静，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。