本发明专利技术提供了一种杂交瘤细胞株BCHJYS10，其保藏号为CGMCC?No.4574。本发明专利技术还提供了由所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，以及含有所述单克隆抗体或生物素标记的所述单克隆抗体的存活素(Survivin)酶联免疫试剂盒。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测存活素的方法。本发明专利技术提供的检测膀胱癌患者尿中的存活素的酶联免疫试剂盒的方法操作简便，费用低廉，诊断灵敏，可直接定量且方便地检测膀胱癌中存活素，适合于具有无痛性血尿症状，膀胱癌人群的辅助诊断及膀胱癌术后复发的监测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种Survivin酶联免疫试剂盒及其在膀胱癌患者尿Survivin检测中的应用。
技术介绍
膀胱癌是国内泌尿系统中最常见恶性肿瘤，90％以上为移行上皮癌，其中约70％为表浅性，20％为浸润性，早期诊断较困难，5％确诊时已发生转移。膀胱癌诊治后容易复发，且复发肿瘤恶性度增加，故治疗后需终身严密的随访。目前膀胱镜检查及可疑病变处活检仍是膀胱癌诊断和随访的金标准。但是膀胱镜检查会带给患者创伤且检测费用昂贵，同时细胞学检查敏感性低，尽管其特异性能到达94％而相应的敏感性只有35％。细胞学检测的低灵敏性与膀胱镜检的侵入性使得人们对一些非浸入性诊断方法产生了较大兴趣。在过去的的几十年，生物标志物的发展给我们带来了一些新的膀胱癌检测与随访的方法。Survivin是1997年Altieri等在研究效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell protease receptor-1，EPR-1)cDNA，在人类基因组库中筛选克隆时首先被发现，因其具有强大的抗细胞凋亡功能，被命名为“存活素或生存素”。Survivin作为一种新型的肿瘤标志物，有报道在膀胱癌的诊断中有比较好的敏感性与特异性，但未完全证实。目前对Survivin检测方法主要有RT-PCR，Real-time PCR及酶联免疫(ELISA)。RT-PCR虽然灵敏，但容易污染。它只是一种定性的检测，且操作繁琐。Real-time PCR采用独特封闭反应，减少了污染，可靠性高，且操作时间短，但该检测的设备与试剂昂贵限制了它的使用与普及。ELISA以抗体包被微孔板的形式，具有灵敏度高，费用低，大通量，在肿瘤标志物的检测中使用比较常见。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种存活素(Survivin)单克隆抗体，酶联免疫试剂盒及其在膀胱癌尿检中的应用。本专利技术提供的存活素单克隆抗体是由杂交瘤细胞株BCHJYS10产生的，是通过大肠杆菌制备的Survivin蛋白，再用纯化的蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本专利技术提供的杂交瘤细胞株BCHJYS10，已于2011年01月29号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，保藏号为CGMCCNo.4574。本专利技术还提供含有所述的杂交瘤细胞株BCHJYS10产生的单克隆抗体或生物素标记的所述的单克隆抗体的Survivin酶联免疫试剂盒。本专利技术提供的Survivin的酶联免疫试剂盒，它还包括：酶标板、存活素标准品、酶标二抗或酶标亲和素、存活素多克隆抗体或生物素标记的多克隆抗体、底物显色液、终止-->液、洗涤液、稀释液；其中，包被酶标板所用的缓冲液为0.02～0.05mol/L的碳酸缓冲液，pH值为9.1～9.9；所用的封闭液为含有1～100mg/ml脱脂奶粉的PBS溶液。本专利技术所述的试剂盒中特异性抗体为Survivin单克隆抗体或多克隆抗体，浓度为0.1～20μg/ml，优选为1～5μg/ml；生物素标记的Survivin单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为0.1～20μg/ml，优选为1～5μg/ml。本专利技术所述的试剂盒中，用于标记的生物素与单克隆抗体或多克隆抗体按质量比1∶1～4结合，优选为1∶2。本专利技术所述的试剂盒中生物素标记的抗体是按照如下方式制备的：1)将NHS-Biotin(N-羟基丁二酰亚胺酯化生物素)5mg溶于0.5ml DMSO中，最终浓度为10mg/ml；2)浓度在1mg/ml以上的单抗或多抗，标记前在碳酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH8.2-8.6)中充分透析。4℃1-2h，1L碳酸缓冲液，可搅拌；3)biotin与单抗或多抗的质量比为1∶2，即1mg单抗或多抗加入500μg的生物素酯(NHS-Biotin-DMSO液50μl)混匀后，室温避光旋转混匀4小时；4)以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。本专利技术所述的试剂盒，当Survivin单抗作为包被抗体时，Survivin多抗或生物素标记的Survivin多抗作为捕获抗体；当Survivin多抗作为包被抗体时，Survivin单抗或生物素标记的Survivin单抗作为捕获抗体。本专利技术所述的试剂盒中，当捕获抗体为存活素单克隆抗体或多克隆抗体时含有酶标二抗；当捕获抗体为生物素标记的存活素单克隆抗体或多克隆抗体时含有酶标亲和素。本专利技术所述试剂盒中所用稀释液为含有50mg/ml脱脂奶粉和0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液，所用洗涤液为含有0.05％(v/v)Tween-20的PBS溶液。其中的脱脂奶粉和Tween-20能减少非特异性吸附，同时Tween-20能增加抗原抗体的相互作用而增加灵敏性。本专利技术酶标板的制备过程：用包被液将Survivin的单克隆抗体或多克隆抗体稀释到1～5μg/ml，每孔加入100μl。置于4℃16小时后再倾去包被液体，用洗涤液体洗涤三次，每次1分钟，拍干。然后每孔加入200ul的封闭液37℃温育1小时，倾去孔内液体拍干备用。在本专利技术的一个实施方案中，当所述的酶标二抗或酶标生物素所用的酶为辣根过氧化物酶时，所述的显色液为含有四甲基联苯胺(TMB)的pH为5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液。优选按如下配方配制：10mgTMB+1ml DMSO+99ml 0.1M pH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液+11μl 30％(v/v)双氧水比例配制。本专利技术所述试剂盒的终止液为12.5％(v/v)的硫酸。本专利技术中单克隆抗制备的过程为：用上述免疫原免疫Balb/c雌性小鼠，再将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤融合，经过多次亚克隆，筛选到能稳定分泌Survivin单克隆抗体的杂交瘤细胞。选择其中一株较好的交瘤细胞株BCHJYS10，采用体内诱生腹水法，挑选经产Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油，向预处理后的小鼠腹腔注射阳性克隆杂交瘤细胞，待7-10天后，小鼠腹部明显增大，刺穿腹腔，采集腹水。将腹水离心，弃脂肪层和细胞层，收集中间的澄清层，-70℃保-->存备用。用质量分数为35％的饱和硫酸铵盐析法粗提细胞培养上清和腹水，最后用HiTrap Protein G HP免疫层析法进一步纯化，获得纯化的Survivin单克隆抗体。使用本专利技术的试剂盒检测的一种实施方式为：包被抗体为Survivin单克隆抗体，加入待测尿标本(膀胱癌患者或正常人的尿)或标准Survivin蛋白，温育，洗涤后加入Survivin多抗。再温育，洗涤后再加入辣根过氧化酶标记的二抗。再温育，洗涤液洗涤后加入底物液显色，终止然后用酶标仪检测OD450的读数。使用本专利技术的试剂盒检测的另一种实施方式为：包被抗体为Survivin单克隆抗体，加入待测尿标本(膀胱癌患者或正常人的尿)或标准Survivin蛋白，温育，洗涤后加入生物素标记的Survivin多抗。再温育，洗涤后再加入辣根过氧化酶标记的亲和素。再温育，洗涤液洗涤后加入底物液显色，终止然后用酶标仪检测OD450的读数。使用本专利技术的试剂盒检测的另一种实施方式为：包被抗体为Survivin多克隆抗体，加入待测尿标本(膀胱癌患者或正本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种杂交瘤细胞株ＢＣＨＪＹＳ１０，其保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４５７４。
【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株BCHJYS10，其保藏号为CGMCC No.4574。2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的存活素单克隆抗体。3.含有权利要求2所述的单克隆抗体或生物素标记的权利要求2所述的单克隆抗体的存活素酶联免疫试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括酶标板、存活素标准品、酶标二抗或酶标亲和素、存活素多克隆抗体或生物素标记的多克隆抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、稀释液；其中，包被酶标板所用的缓冲液为0.02～0.05mol/L的碳酸缓冲液，pH值为9.1～9.9；所用的封闭液为含有1～100mg/ml脱脂奶粉的PBS溶液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的存活素单克隆抗体和多克隆抗体的浓度为0.1～20μg/ml；所述的生物素标记的存活素单克隆抗体和多克隆抗体的浓度为0.1～20μg/ml。6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，当存活素单抗作为包被抗体时，存活素多抗或生物素标记的存活素多抗作为捕获抗体；当存活素多抗作为包被抗体时，存活素单抗或生物素标记的存活素单抗作为捕获...
【专利技术属性】
技术研发人员：张青云，
申请(专利权)人：北京市肿瘤防治研究所，
类型：发明
国别省市：11
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