【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及类器官培养，具体涉及一种黑色素瘤类器官培养基、培养黑色素瘤类器官的方法及其用途。
技术介绍
1、黑色素瘤是一类恶性程度高，预后差的肿瘤，黑色素瘤基于基因变异可以分为4种基本亚型，其中肢端型和黏膜型是我国黑色素瘤的主要亚型。
2、目前临床上用于治疗黑色素瘤的药物主要包括以下几类：（1）化疗药物：常用的化疗药物有达卡巴嗪、顺铂、博来霉素、紫杉醇、顺铂、博来霉素等，大部分化疗药物可以口服，也可通过静脉注射或者是静脉滴注的方式使用。化疗药物通常联合紫杉醇进行治疗，对于晚期的黑色素瘤具有一定的效果。（2）靶向药物：靶向药物是指能够通过特定蛋白质，即靶点来杀伤肿瘤细胞的药物，常用药物有曲妥珠单抗、厄洛替尼、阿帕替尼等。（3）免疫药物：免疫药物是指可以提高免疫系统对肿瘤细胞的免疫功能，从而抑制肿瘤细胞的生长和增殖的药物，常用的免疫药物有卡介苗、他克莫司等。上述药物虽然对黑色素瘤具有一定的治疗效果，但是还存在对部分黑色素瘤患者不起作用、副作用强等缺陷，迫切需要开发新的治疗黑色素瘤的药物。
3、肿瘤类器官是一类高度模拟肿瘤微环境的体外培养模型，该模型取材自患者手术、穿刺或其他途径分离的肿瘤组织，经体外培养后，可形成规则的、具有三维结构的肿瘤团块，该团块与患者肿瘤组织在表达谱、微环境等特征上高度近似，可以模拟患者体内的肿瘤组织，用于抗癌药物的体外快速筛选。以免疫检查点抑制剂为主的免疫治疗和以car-t疗法为主的细胞治疗技术近年来发展迅速，已成为黑色素瘤治疗的重要手段，类器官作为近年来出现的肿瘤培养技术，也可用于
技术实现思路
1、本专利技术的专利技术人团队长期致力于黑色素瘤的研究，为了培养适用于药物筛选的黑色素瘤类器官进行了大量摸索，在以往研究经验的基础上付出创造性的劳动，设计培养基配方，并经过大量实验优化，获得适合于各种类型黑色素瘤的类器官生长的培养基。此外，本专利技术人还开发了一种基于气液界面类器官评价黑色素瘤免疫治疗效果的方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、在第一个方面，本专利技术提供了一种黑色素瘤类器官培养基，所述培养基包括基础培养基和以下组分：内皮素-1，bpe，hepes，glutamax，primocin，normocin，b27无维生素a，n-乙酰半胱氨酸，烟酰胺，rhegf，bfgf，y27632，a83-01，sb202190，fgf-10，毛侯素和肝素。
4、优选的，所述培养基不包含wnt3a、noggin和r-spondin-1中的任一种。
5、优选的，所述基础培养基是advanced dmem/f12培养基。
6、优选的，所述培养基中以下组分的浓度范围如下所示：0.2-400 ng/ml内皮素-1，10-160 μg/ml bpe，0.5-10 mm hepes，1-10 mm glutamax，0.05-1 mg/ml primocin，0.05-1 mg/ml normocin，以体积百分比计0.5-10% b27无维生素a，0.1-10 mm n-乙酰半胱氨酸，1-50 mm烟酰胺，20-100 ng/ml rhegf，5-50 ng/ml bfgf，5-50 μm y27632，0.25-2 μma83-01，2.5-10 μm sb202190，50-800 ng/ml fgf-10，0.25-4 μm毛侯素和12.5-200 u/ml肝素。
7、更优选的，所述培养基中以下组分的浓度范围如下所示：5-20 ng/ml 内皮素-1，20-80 μg/ml bpe，0.5-2 mm hepes，1-4 mm glutamax，0.05-0.2 mg/ml primocin，0.05-0.2 mg/ml normocin，以体积百分比计1-4% b27无维生素a，0.5-2 mm n-乙酰半胱氨酸，5-20 mm 烟酰胺，25-100 ng/ml rhegf，10-40 ng/ml bfgf，5-20 μm y27632，0.25-1 μma83-01，2.5-10 μm sb202190，100-400 ng/ml fgf-10，0.5-2 μm毛侯素和25-100 u/ml肝素。
8、另外更优选的，所述培养基中以下组分的浓度范围如下所示：10 ng/ml 内皮素-1，40 μg/ml bpe，1 mm hepes，2 mm glutamax，0.1 mg/ml primocin，0.1 mg/mlnormocin，以体积百分比计2% b27无维生素a，1 mm n-乙酰半胱氨酸，10 mm 烟酰胺，50ng/ml rhegf，20 ng/ml bfgf，10 μm y27632，0.5 μm a83-01，5 μm sb202190，200 ng/mlfgf-10，1 μm毛侯素和50 u/ml肝素。
9、第二个方面，本专利技术提供一种制备黑色素瘤类器官的方法，包括以下步骤：
10、（1）将黑色素瘤组织样本充分剪碎，加入基础培养基混悬，过滤，取滤液，离心后用基础培养基重悬沉淀获得黑色素瘤细胞悬液；
11、（2）使用固态基质包被transwell板上室；
12、（3）将步骤（1）制备的黑色素瘤细胞悬液混合于固态基质中，接种于预包被的transwell板上室，孵育；
13、（4）将上述第一个方面所述的黑色素瘤类器官培养基加入transwell板下室，培养后获得所述黑色素瘤类器官。
14、优选的，所述基础培养基是advanced dmem/f12培养基。
15、优选地，所述固态基质为i型胶原，基质胶或水凝胶。
16、更优选地，在步骤（2）中使用的所述固态基质是cellmatrix，在步骤（3）中使用的所述固态基质是matrigel。
17、在第三个方面，本专利技术提供了一种黑色素瘤类器官，所述黑色素瘤类器官是利用上述第二个方面所述的方法制备的。
18、在第四个方面，本专利技术提供了上述第三个方面所述的黑色素瘤类器官在筛选黑色素瘤治疗药物中的用途。
19、在第五个方面，本专利技术提供了一种用于黑色素瘤类器官和免疫细胞共培养的培养基，所述培养基包含上述第一个方面所述的黑色素瘤类器官培养基和添加剂，所述添加剂包含il-2，il-7和il-15。
20、优选的，所述添加剂的浓度范围如下所示：200-1000 u/ml il-2，50-200 ng/mlil-7和10-50 ng/ml il-15。
21、进一步优选的，所述添加剂的浓度如下所示：200 u/ml il-2，50 ng/ml il-7和1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种黑色素瘤类器官培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和以下组分：内皮素-1，牛脑垂体提取物（BPE），HEPES，GlutaMAX，Primocin，Normocin，B27无维生素A，N-乙酰半胱氨酸，烟酰胺，rhEGF，bFGF，Y27632，A83-01，SB202190，FGF-10，毛侯素和肝素，所述培养基不包含Wnt3a、Noggin和R-spondin-1中的任一种。
2.如权利要求1所述的黑色素瘤类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基是ADVANCED DMEM/F12培养基。
3.如权利要求1或权利要求2所述的黑色素瘤类器官培养基，其特征在于，所述培养基中以下组分的浓度范围如下所示：0.2-400 ng/mL内皮素-1，10-160 μg/mL BPE，0.5-10 mMHEPES，1-10 mM GlutaMAX，0.05-1 mg/mL Primocin，0.05-1 mg/mL Normocin，以体积百分比计0.5-10% B27无维生素A，0.1-10 mM N-乙酰半胱氨酸，1-50 mM烟酰胺，20-100
4.一种制备黑色素瘤类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基础培养基是ADVANCED DMEM/F12培养基，所述固态基质为I型胶原，基质胶或水凝胶。
6.一种黑色素瘤类器官，其特征在于，所述黑色素瘤类器官是利用权利要求4或权利要求5所述的方法制备的。
7.权利要求6所述的黑色素瘤类器官在筛选黑色素瘤治疗药物中的用途。
8.一种用于黑色素瘤类器官和免疫细胞共培养的培养基，其特征在于，所述培养基包含权利要求1至3中任一项所述的黑色素瘤类器官培养基和添加剂，所述添加剂包含IL-2，IL-7和IL-15。
9.一种用于非诊断目的的基于气液界面类器官评价免疫细胞对黑色素瘤杀伤效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞是经过体外编辑或未经过体外编辑的T细胞或NK细胞，所述固态基质为I型胶原，基质胶或水凝胶。
11.一种基于气液界面类器官评价免疫细胞对黑色素瘤杀伤效果的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至3中任一项所述的黑色素瘤类器官培养基，权利要求8所述的用于黑色素瘤类器官和免疫细胞共培养的培养基和Transwell板。
...【技术特征摘要】
1.一种黑色素瘤类器官培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和以下组分：内皮素-1，牛脑垂体提取物（bpe），hepes，glutamax，primocin，normocin，b27无维生素a，n-乙酰半胱氨酸，烟酰胺，rhegf，bfgf，y27632，a83-01，sb202190，fgf-10，毛侯素和肝素，所述培养基不包含wnt3a、noggin和r-spondin-1中的任一种。
2.如权利要求1所述的黑色素瘤类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基是advanced dmem/f12培养基。
3.如权利要求1或权利要求2所述的黑色素瘤类器官培养基，其特征在于，所述培养基中以下组分的浓度范围如下所示：0.2-400 ng/ml内皮素-1，10-160 μg/ml bpe，0.5-10 mmhepes，1-10 mm glutamax，0.05-1 mg/ml primocin，0.05-1 mg/ml normocin，以体积百分比计0.5-10% b27无维生素a，0.1-10 mm n-乙酰半胱氨酸，1-50 mm烟酰胺，20-100 ng/mlrhegf，5-50 ng/ml bfgf，5-50 μm y27632，0.25-2 μm a83-01，2.5-10 μm sb202190，50-800 ng/ml fgf-10，0....
【专利技术属性】
技术研发人员：孔燕，张峰浩，郭军，
申请(专利权)人：北京市肿瘤防治研究所，
类型：发明
国别省市：
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