本发明专利技术提供了一种基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法，其是将目的蛋白、含可切割位点的肽段(优选为内含肽)以及具有自聚集功能的短肽按从左至右或从右之左的顺序融合表达为三联体，在表达过程中形成酶聚集体，可通过离心或过滤方法与细胞裂解液中大部分可溶杂质分离；之后通过诱导可切割位点处的切割将目的蛋白从聚集体释放到溶液中，从而达到纯化目的。该方法具有成本低，流程简单的特点，可用于实验室规模的高通量蛋白纯化，也有利于工业规模的蛋白生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组蛋白的表达及纯化，具体地说，涉及一种。
技术介绍
重组蛋白的生产，无论在工业领域还是实验室规模都十分重要，而重组蛋白的分离与纯化成本约占其全部成本的60% -80% (陈浩，陈于红，朱德煦，刘建宁，重组蛋白纯化技术，中国生物工程杂志，2002，22 (5) :p. 87-92.)。重组蛋白的纯化可以分为样品制备、 捕获、中度纯化和精细纯化等4步，其中中度纯化可以达到适中的样品纯度，其处理后的蛋白样品可以被用于多种实验分析目的如N端序列分析、抗原抗体反应等。目前可以实现蛋白质中度纯化的方法包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析，以及近期的研究热点如自切割自聚集功能的融合标签表达等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件有一定的要求，通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得超过90 %的高收率，使其成为目前最常用的重组蛋白中度纯化方法之一。实验室中常用的亲和纯化技术包括多组氨酸标签(his-tag)或谷胱甘肽转移酶标签(GST-tag)与目的蛋白的融合表达，为不同目的蛋白的生产提供了通用的纯化手段(Arnau，J.，C. Lauritzen 等,Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification, 2006. 48(1) :p. 1-13.)。然而昂贵纯化柱的使用和为了移除融合表达标签而需要蛋白酶的加入，这两个主要缺点使亲和纯化成本较高，不利于工业领域的应用。设计具有自聚集自切割功能的融合标签以克服上述缺点。来自典型性猪瘟病毒 (CSFV)N-端的具有蛋白酶活性且有强烈的形成不可溶聚集体趋势的Npm，就具备了将聚集纯化和蛋白质剪切集于一身的特点。但是利用Npm方法需要对目的蛋白进行复性和进一步的精细纯化来去除产物中的Npm融合片段(Achmuller，C.，W. Kaar等，N-profusion technology to produce proteins with authentic N termini in E-coli. Nature Methods，2007. 4 :p. 1037-1043.)。将具有诱导聚集功能的类弹性蛋白(Elastin-Like Polypeptide, ELP)与具有自切割功能的内含肽(Intein)结合，构建出的新融合标签可以产生与Npm相似的功效。与这一标签融合表达的蛋白可以通过控制温度或盐度，在分离后的溶液和沉淀之间不断转换，从而达到纯化目的(Meyer，D. Ε. and A. Chilkoti.， Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology,1999. 17 (11) :p. 1112-1115. ；Banki, Μ. R., L. A. Feng 等，Simple bioseparations using self-cleaving elastin-like polypeptide tags. Nature Methods, 2005. 2 (9) :p. 659-661. ；Ge, X. , D. S. C. Yang，等，Self-cleavable stimulus responsive tags for protein purification without chromatography. Journal of the American Chemical Society, 2005. 127(32) :p. 11228-11229.)。但是反复进行的温度或盐度调节，有可能影响纯化蛋白活性，并且多步操作不利于简化工艺流程。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有蛋白纯化技术中成本高、使用蛋白酶、操作步骤较多等不足，提供一种具有自聚集自切割功能的融合标签，以及利用该融合标签进行重组蛋白快速纯化的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种，1)将目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白融合表达，所述的融合蛋白的连接顺序为目的蛋白-含可切割位点的肽段-自聚集短肽或自聚集短肽-含可切割位点的肽段-目的蛋白；2)将表达上述融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心和/或过滤获得沉淀，然后利用与可切割位点对应的切割方式，诱导切割位点断裂释放可溶目的蛋白，最后进行离心和/ 或过滤，得上清。前述的蛋白质纯化方法，步骤1)中所述自聚集短肽具有SEQ IDNo :3、SEQ ID No 4、SEQ ID No :5或SEQ ID No 6所示的氨基酸序列(含Linker)。前述的蛋白质纯化方法，步骤1)中所述的与可切割位点对应的切割方式为具有自切割功能的内含肽的自切害I]、酶法或化学法等，优选为具有自切割功能的内含肽的自切割。所述内含肽如DnaB或Mxe GyrA，优选为Mxe GyrA内含肽。前述的蛋白质纯化方法，步骤2、中所述宿主细胞为原核微生物或真菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母等。本专利技术的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。将具有诱导聚集功能的短肽与有自切割功能的内含肽以及目的纯化蛋白按从左到右或从右到左两种顺序融合表达。诱导聚集功能的短肽会使融合蛋白三联体在微生物胞内表达时形成不可溶的聚集体体，可以利用简单的离心或过滤手段使融合蛋白三联体与细菌裂解液中的杂质成分分离。内含肽是一段具有蛋白酶活性的特殊序列多肽，在诱导其蛋白酶活性产生后可以在设计位点的特定氨基酸残基切割，从而释放可溶的目的蛋白到溶液中。大部分融合蛋白三联体可以在表达时以酶聚集体形式表达，在离心分离细胞破碎液后， 可以在沉淀中大量获得。之后通过更换缓冲液诱导内含肽剪切相应的识别位点，从而将目的蛋白释放到溶液里，而内含肽-自聚集短肽部分仍然在沉淀之中。最后利用简单的离心或过滤分离溶液和不溶物，从而在溶液中获得较高纯度的目的蛋白。具体地，包括以下步骤1)通过聚合酶链式反应(PCR)、限制性酶切和粘性末端连接技术，构建表达三联体融合蛋白的基因序列，并将其连接入含有抗性基因的表达载体中，将所述表达载体导入宿主中，培养宿主并诱导表达，得到所述融合蛋白三联体。2)将表达融合蛋白三联体的宿主菌液破碎，之后利用离心的方法分离沉淀和上清，其中融合蛋白三联体在沉淀中。洗涤后利用内含肽对应的切割缓冲液重悬融合蛋白三联体，保持一定温度并在一定时间后离心分离缓冲液和沉淀，目的蛋白即存在于缓冲液中。其中，步骤1)中所述宿主可为大肠杆菌(Escherichia coli)，所述含有抗性基因的表达载体为可在上述宿主中表达的载体，如pET-30a(+)。所述融合蛋白三联体中有诱导聚集功能的短肽序列可为下述氨基酸序列之一a. SEQ ID No 3 ；b. SEQ ID No 4 ；c. SEQ ID No 5 ；d.SEQIDNo:6。步骤2)中所述内含肽可以是kp 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于自聚集短肽诱导的酶聚集体的蛋白质纯化方法，其特征在于，１）将目的蛋白、含可切割位点的肽段和自聚集短肽的融合蛋白融合表达，所述的融合蛋白的连接顺序为目的蛋白－含可切割位点的肽段－自聚集短肽或自聚集短肽－含可切割位点的肽段－目的蛋白；２）将表达上述融合蛋白的宿主细胞破碎后，离心和／或过滤获得沉淀，然后利用与可切割位点对应的切割方式，诱导切割位点断裂释放可溶目的蛋白，最后进行离心和／或过滤，得上清。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林章凛，邢磊，吴伟，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11
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