本发明专利技术提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽及其分离纯化方法和应用。本发明专利技术的方法包括步骤：S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体；S2，加入硫酸铵，静置分离出蛋白沉淀，用缓冲液重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集滤出液；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液15％时的UV280产物峰产物，能获得高纯度的单一组分，无杂质蛋白，对植物病原菌具有显著抑菌活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物防治领域，具体涉及微生物农药，更具体的涉及一种和农药制剂。
技术介绍
过去几十年中，在农业生产过程中应用了大量的化学药物以达到防治或减轻病虫、杂草造成的危害的目的，为保护农业生产提供了有力的支持。在一段时间内，化学防治仍是重要且有效的植物病害防治方法之一。20世纪初，DDT、六六六和有机磷农药的出现，推动了化学农药在世界范围内的扩展。但是化学农药的毒性高，结构相对稳定而难以降解，大量使用易残留，并且会渗透至土壤和地下水中，降低土壤质量，造成环境破坏，影响生态平衡，同时危害人体健康。在长期使用某些化学农药的过程中，病原菌逐渐形成了耐药机制，农药用量不断加大，而效果却不增反减。此外，化学农药研发成本高，周期长等难题困扰着研发人员。为此，活性抑病原菌物质等生物农药的研制被列入议程。枯草芽孢杆菌作为一种安全的有益微生物被人们所公认，对环境无污染，对人畜无毒害，在其代谢过程中所产生的多种肽类、氨基酸和多烯类都表现出一定的抗菌能力，对于黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、番茄灰霉病菌等多种病原菌、以及细菌和病毒的生长具有抑制作用，对于植物生长病害、果蔬采后病害和保鲜等方面的生物防治均具有较大应用价值。枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及鉴定为阐明其抑菌作用的物质基础和作用机理具有重要意义，同时也是大规模生产抗菌物质的简化实例。研宄表明枯草芽孢杆菌可以分泌多种抑菌物质，以合成途径为依据可以划分为核糖体合成途径产生以及非核糖体合成途径产生。经由核糖体合成途径合成的抗菌物质主要为抑菌蛋白以及多肽；非核糖体合成途径主要合成具有两亲性的脂肽类抗生素，部分抑菌素可以经由核糖体途径合成，如subtilosin A，sublancin，TasA等。野生型枯草芽孢杆菌菌株能够合成超过40种结构和功能不尽相同的抑菌物质，其中部分抑菌功能基因已被克隆和表达。枯草芽孢杆菌的表达产物复杂，其表达的小肽难以用常规方式进行分离纯化，给其应用带来了障碍。
技术实现思路
为了解决枯草芽孢杆菌的表达产物复杂，其表达的小肽难以用现有方式进行分离纯化，给其应用带来了障碍的技术问题，本专利技术提供一种能获得高纯度的单一组分蛋白的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法及其制备的枯草芽孢杆菌抗菌肽及其应用。本专利技术的第一方面提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其步骤包括:SI，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体得无菌发酵液；S2，0-4°C下缓慢向无菌发酵液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量分数为89-90%，静置分离出蛋白沉淀，用PH = 7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集0.35-0.4Mpa压力下的滤出液得粗提液，所述超滤系统的滤膜为Ultracell 3kDa滤膜；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100%时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液百分比为15%时的UV280吸收峰产物得枯草芽孢杆菌抗菌肽。本专利技术的第二方面提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽，由上述分离纯化方法制得。本专利技术的第三方面提供上述枯草芽孢杆菌抗菌肽的应用，所述枯草芽孢杆菌抗菌肽用于防治植物病害。经抑菌实验证明，本专利技术的枯草芽孢杆菌抗菌肽能有效抑制小麦赤霉，且浓度越高抑制作用越明显，尤其在50mg/mL浓度可显著抑制小麦赤霉活性。本专利技术的枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法是一种以抗菌肽为代表的细菌蛋白产物的分离纯化方法，通过多步分离纯化对枯草芽孢杆菌SY-ND(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2011年9月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCCN0.5224)所表达的抗菌肽进行纯化分离获取其单一组分。采用本专利技术枯草芽孢杆菌表达抗菌肽的分离纯化方法可以得到高纯度的枯草芽孢杆菌SY-ND表达的抗植物病原菌肽，无杂质蛋白，对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌具有显著抑菌活性。【附图说明】图1是本专利技术实施例1中枯草芽孢杆菌SY-ND表达抗菌肽SY-ND-BSp在步骤3中进行脱盐层析的图谱。图2是本专利技术实施例1中步骤4离子交换层析的结果图谱。图3是本专利技术实施例1中步骤5疏水层析的结果图谱。图4是本专利技术实施例1中步骤6中对疏水层析单一性检测的结果图谱。【具体实施方式】为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供了一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其步骤包括:S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体得无菌发酵液；S2，0-4°C下缓慢向无菌发酵液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量分数为89-90%，静置分离出蛋白沉淀，用pH = 7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液(Tris-Cl缓冲液)重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集0.35-0.4Mpa压力下的滤出液得粗提液，所述超滤系统的滤膜为Ultracell 3kDa滤膜；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100%时UV280下的吸收峰产物并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液百分比为15%时的UV280产物峰产物得枯草芽孢杆菌抗菌肽，可以得到高纯度的枯草芽孢杆菌SY-ND表达的抗植物病原菌肽，无杂质蛋白，对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌等植物病原菌具有显著抑菌活性。其中，枯草芽孢杆菌发酵液为对菌株进行发酵培养所得发酵液。优选，通过以下步骤实现，挑取冻存保藏的枯草芽孢杆菌菌株至少量的LB液体培养基(胰蛋白胨Tryptone10g/L、酵母提取物Yeast extract 10g/L、氯化钠NaCl 5g/L，用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4)中，进行复苏培养，后再在稍多的LB液体培养基中进行扩大培养，最后转入更多的LB培养基进行发酵培养。其中，枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SY-ND，其菌株从土壤样品中分离筛选获得，已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC N0.5224，经抑菌试验证实其表达产物具有显著的抑制植物病原菌的活性，其发酵液经蛋白酶处理后丧失活性，表明其活性物质为蛋白，经抑菌试验确定抗植物病原菌有活性的分子量<3kDa。优选，步骤SI包括将发酵液离心，取上清，上清依次通过滤纸、0.45 μπκΟ.22 μπι孔径滤膜抽滤除去菌体，能更好的去除菌体。优选，步骤S2的超滤系统为amicon8400超滤系统。优选，步骤S3的脱盐层析的填料为Sephadex G25Fine，洗脱液为pH = 7.0-7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液，洗脱速度为0.8-1.0mL/min。优选，步骤S4的离子交换层析的填料为弱阴离子交换填料，洗脱液为pH =8.0-8.2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的分离纯化方法，其特征在于，包括步骤：S1，对枯草芽孢杆菌发酵液进行菌液分离，除去菌体得无菌发酵液；S2，0‑4℃下向无菌发酵液中加入硫酸铵至硫酸铵的质量分数为85‑90％，静置分离出蛋白沉淀，用pH＝7.0‑7.2的三羟甲基氨基甲烷与盐酸的缓冲液重溶蛋白沉淀，后于超滤系统下收集0.35‑0.4Mpa压力下的滤出液得粗提液，所述超滤系统的滤膜为Ultracell 3kDa滤膜；S3，对粗提液进行脱盐层析，收集UV280下的首个吸收峰产物；S4，对步骤S3脱盐层析产物进行离子交换层析，收集洗脱液100％时UV280下的吸收峰产物，并进行冻干浓缩；S5，将冻干的离子交换层析产物重溶，后用蛋白质纯化系统进行疏水层析，收取缓冲液百分比为15％时的UV280吸收峰产物，得到枯草芽孢杆菌抗菌肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胥维昌，王宇，李秀颖，李丹，盛志，孙慧，李旭，
申请(专利权)人：沈阳化工研究院有限公司，中国中化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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