一种花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌及其筛选纯化方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种花椒叶内生菌沙芬西芽孢杆菌(Bacillus safensis)GHF4的筛选纯化方法和用途应用，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014535，名称为GHF4。其特点是以新鲜花椒叶为原料，采取消毒清洗、平板富集培养、梯度稀释平板涂布、初筛、复筛等方法进行筛选和纯化。其发酵代谢产物具有较强的抗氧化活性，当发酵液浓度为3.75mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率达到99.48％，IC50值为0.80mg/mL。在天然抗氧化剂的生产方面具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌及其筛选纯化方法和用途
本专利技术涉及一种花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌及其筛选纯化方法和用途。本专利技术得到的菌株已于2014年10月31日中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCM2014535，分类名称：沙芬西芽孢杆菌GHF4(BacillussafensisGHF4)。
技术介绍
随着社会的发展，人们对健康有了新需求，天然抗氧化剂因其应用范围广，毒副作用小，越来越受关注，而提取天然抗氧化活性物质更是众多学者一直研究的热点。近年来，植物内生菌倍受关注，许多国内外研究证实，植物内生菌是一种可开发利用的新型资源，它在与宿主相互作用过程中，不仅具有促进植物生长，提高植物抗病性的能力,而且还能代谢与宿主相同或相类似的活性物质，植物内生菌代谢产物是一种潜在的资源，大多具有生物学活性，如抗菌、抗病毒等作用(Schulz,B.,Boyle,C.,Draeger,S.,A.K.,&Krohn,K.Endophyticfungi:Asourceofnovelbiologicallyactivesecondarymetabolites[J].MycologicalResearch,2002,106:996–1004.)。因其具有高产、环境友好，安全等特点，所以使其在食品、药品等行业中的应用具有广阔前景。目前，未见有关于从花椒叶中分离得到内生沙芬西芽孢杆菌的专利和非专利文献报道，也没有关于花椒叶内生菌代谢产物有抗氧化性的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌，并在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO.：M2014535；本专利技术的另一个目的是该花椒叶内生菌的抗氧化活性的应用。本专利技术的花椒内生菌是专利技术人从花椒叶中分离得到的一株沙芬西芽孢杆菌，经传统方法鉴定和分子鉴定表明它属于内生沙芬西芽孢杆菌，并将其命名为GHF4。本专利技术的花椒叶内生菌——GHF4已于2014年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM2014535。花椒叶内生沙芬西芽孢杆菌的筛选及纯化包括以下步骤：(1)清洗消毒在无菌操作台内，用无菌水冲洗新鲜花椒叶3次，再用浓度为0.5～1.5％次氯酸钠溶液浸泡新鲜红花椒叶3～8min，之后用浓度为75％的乙醇消毒5～10min，无菌水冲洗3次，并保留最后一次洗涤用水作为对照；(2)富集培养将上述清洗消毒处理的新鲜红花椒叶，在研钵中研磨捣碎，接种于含有1％重铬酸钾的营养琼脂固体培养基，于温度28～30℃恒温培养箱下培养5～7天，观察有菌落长出；(3)平板涂布将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28～30℃恒温培养箱中培养5～7天后挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线后置于温度28～30℃的恒温培养箱中培养5天；(4)初筛将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中挑取细菌特征菌落，于无菌生理盐水中梯度稀释后平板涂布，置于温度28～30℃恒温培养箱中培养5～7天后，挑取细菌菌落在营养琼脂固体培养基上平板划线，置于28～30℃的恒温培养箱中培养5～7天；挑选以上步骤得到的单菌落，划线接种于新的营养琼脂固体培养基中；(5)复筛将步骤(3)所得菌株接种到营养琼脂液体培养基中，在温度28～30℃摇床中发酵培养，将发酵液离心后取上清液，通过2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除实验评价发酵液抗氧化性后，将发酵液抗氧化活性最强菌株编号并保藏；(6)生理生化特征和16SrDNA分析生理生化特征和16SrDNA分析，确定筛选菌株的种类。所述富集培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂1.5％，pH为7.0～7.6，灭菌后加入1％重铬酸钾；营养琼脂固体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂1.5％，pH为7.0～7.6；营养琼脂液体培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，pH为7.0～7.6。性能测试与结构表征生理生化特征：如表1所示，16SrDNA分析：详见SEQUENCELISTING。经过上述6个筛选步骤所得菌株分别在光学显微镜(革兰氏染色后)以及电子显微镜下观察细菌，其形态特征：本专利技术菌种为革兰氏阳性菌，菌体单个短杆状，表面光滑，长1.0～1.1μm，宽0.5μm，在营养琼脂培养基上生长良好，菌落形态呈乳白色，表面光滑，菌落边缘不平整；生长温度为28～30℃，菌种的生长能够利用葡萄糖、蜜二糖、纤维二糖作为唯一碳源，经过分子扩增测序得到该菌株CCTCCM2014535的16SrDNA序列与沙芬西芽孢杆菌Bacillussafensis(GENEBANK登录号为NR_113945.1)分子同源性最高，达99％以上。本专利技术对沙芬西芽孢杆菌CCTCCM2014535的发酵液进行HPLC分析，高效液相色谱分析条件如下：ODS-3色谱柱(5μm)；流速，1mL/min；柱温，25℃；检测波长，254nm；梯度洗脱液：0min，0％甲醇(0.1％甲酸)；10min，20％甲醇(0.1％甲酸)；20min，25％甲醇(0.1％甲酸)；30min～40min，100％甲醇(0.1％甲酸)。本专利技术的沙芬西芽孢杆菌CCTCCM2014535发酵液的抗氧化作用包括以下步骤：(1)将营养琼脂液体培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取少许纯化后的菌种于培养瓶中，在温度28～30℃摇床培养48h，发酵液经4000r/min离心10min，取上清液，减压浓缩干燥后得花椒叶内生菌发酵液提取物；(2)将花椒叶内生菌发酵液提取物分别以18.75mg/mL，12.5mg/mL，6.25mg/mL，3.125mg/mL，1.25mg/mL的浓度加入96孔板，加入量为50μL/孔，再在96孔板中加入200μLABTS工作液。在避光条件下，进行自由基清除实验反应30min，反应结束后立即测定各个反应液的吸光度，并计算清除率及半抑制浓度值(IC50)。本专利技术具有如下优点：1、筛选方法简单，操作方便。2、筛选得到的花椒叶内生菌GHF4为沙芬西芽孢杆菌。3、筛选得到的花椒叶内生菌菌株发酵液具有较好的抗氧化活性。附图说明图1a为菌株CCTCCM2014535的扫描电镜图图1b为菌株CCTCCM2014535的扫描电镜放大图图2为菌株CCTCCM2014535的ABTS自由基清除活性图图3为菌株CCTCCM2014535的发酵液的HPLC分析图谱具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本专利技术的内容作出一些非本质的改进和调整。实施例1：(1)清洗消毒在无菌操作台内，无菌水冲洗三次，用0.5％次氯酸钠浸泡汉源产新鲜红花花椒叶8min后，用75％的乙醇消毒10min，无菌水冲洗三次，并保留最后一次洗涤用水作为对照。(2)富集培养将表面消毒后的花椒叶研磨后接种于营养琼脂培养基平板，于温度28℃恒温培养箱中培养5天。(3)平板涂布将上述营养琼脂固体培养基培养后的菌落中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株花椒叶内生菌，其特征在于：该菌为沙芬西芽孢杆菌(Bacillus safensis)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC M 2014535。

【技术特征摘要】
1.一株花椒叶内生菌，其特征在于：该菌为沙芬西芽孢杆菌(Bacillussafensis)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCCM2014535。2.权利要求1所述花椒叶内生菌的用途，其特征在于该内生菌发酵液的抗氧化作用包括以下步骤：(1)将营养琼脂液体培养基分装于三角瓶中，用接种环挑取少量纯化后的菌种于培养瓶中，于温度28～30℃摇床培养48h，发酵液经4000r/min离心10mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：高鸿，白津榕，钟凯，黄毅娜，山口五十磨，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51