一株生防枯草芽胞杆菌表面活性素的分离纯化方法技术

本发明专利技术涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bs916胞外抗菌脂肽表面活性素及其分离纯化方法。表面活性素的分子量为1007.6、1021.7和1035.7，属于相差一个亚甲基的同系物。其分离纯化的方法是：首先通过基因敲除构建Bs916合成其它脂肽抗生素能力丧失的突变株BBFM；其次从BBFM的发酵液中采用酸沉淀和甲醇抽提制备表面活性素的粗提物，再次经过NH2和C18层析柱分离纯化表面活性素。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析表明制备的表面活性素达到电泳纯和色谱纯。纯化的表面活性素对开发为抗真菌、抗细菌药物具有较高的研究和应用价值，也可用作为生物化学上的标准品使用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bs916胞外抗菌脂肽表面活性素及其分离纯化方法。表面活性素的分子量为1007.6、1021.7和1035.7，属于相差一个亚甲基的同系物。其分离纯化的方法是：首先通过基因敲除构建Bs916合成其它脂肽抗生素能力丧失的突变株BBFM；其次从BBFM的发酵液中采用酸沉淀和甲醇抽提制备表面活性素的粗提物，再次经过NH2和C18层析柱分离纯化表面活性素。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析表明制备的表面活性素达到电泳纯和色谱纯。纯化的表面活性素对开发为抗真菌、抗细菌药物具有较高的研究和应用价值，也可用作为生物化学上的标准品使用。CGMCC No080820020930【专利说明】
: 本专利技术涉及一株生防枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916的胞外脂肽抗生素表面活性素的分离纯化方法。
技术介绍
枯草芽胞杆菌是植物和土壤生态中的优势生物种群，具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。由于枯草芽胞杆菌胞外能产生丰富的抗菌代谢产物，同时由于其具有生长速度快，存活时间长，对酸、碱、高温、紫外线以及电磁辐射等不良环境的耐受能力强，营养要求简单，安全无毒等优点，因此被广泛的应用于植物真菌病害和细菌病害的防治。 枯草芽胞杆菌分泌的抗菌代谢产物主要有三大类，其一是通过核糖体合成途径合成的多肽类小分子化合物；其二是通过非核糖体合成途径的合成的脂肽类抗生素；其三是合成的一些非蛋白质性质的杂合抗生素。 脂肽类抗生素是一类由亲水性环状短肽头部和长链疏水性脂肪酸尾部组成的双亲性次生代谢产物，具有抗菌活性和溶血性能，在医药、农药和工业上具有广泛的应用价值。脂肽类抗生素根据其化学结构的差异可分为表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和泛革素(Fengycin)三大家簇。 表面活性素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有13?15个碳原子β_羟基脂肪酸交联形成内酯环状结构的极性化合物。表面活性素表现出较强溶血活性、抑制细菌和病毒的活性。伊枯草素家簇结构特点是由7个氨基酸残基的多肽链与含有14?17 β -氨基脂肪酸链相连形成的化合物。伊枯草素也具有较强的溶血活性和强的抗真菌活性。泛革素家簇结构的特点是由10个氨基酸残基的多肽链通过酯键与含有14?18个β -羟基饱和或非饱和的脂肪酸交联形成内酯环。泛革素的溶血作用没有表面活性素和伊枯草素强烈，但表现出强烈的抗真菌活性和弱的抗细菌和病毒活性。 脂肽抗生素的理化性质稳定，如:热稳定好，在121°C高压灭菌30min，活性还能保持在95% ;对胰蛋白酶、蛋白酶K等多种蛋白酶不敏感；对氯仿等有机溶剂具有耐受性；抗紫外照射。脂肽抗生素具有如此高的稳定性，与其分子量小和特殊的环状结构有关。 目前通过构建产脂肽抗生素缺失突变株及突变株抗菌性能的研究表明脂肽抗生素是枯草芽胞杆菌拮抗病原真菌的主要因子。一株具有优良拮抗性能的枯草芽胞杆菌菌株通常能同时合成分泌表面活性素、伊枯草素和泛革素；其中任一一种脂肽类抗生素合成能力的缺失都会导致突变株抗真菌活性不同程度的下降；当其中两种或者三种脂肽类抗生素合成能力的全部缺失，会极大的降低或者导致突变株完全丧失抗真菌活性。表面活性素、伊枯草素和泛革素对植物病原真菌具有协同增效作用。 通过构建表面活性素合成能力丧失突变株，及对表面活性素的生物学功能研究表明表面活性素不仅是生防枯草芽胞杆菌抗菌的关键因子之一，而且表面活性素还具有极强的溶血活性和抗病毒的活性；表面活性素基因簇的突变还能影响枯草芽胞杆菌生物膜的形成，感受态的形成及定殖能力等生命现象。最近研究表明表面活性素还具有抗肿瘤的活性，因此表面活性素在医药、工业和农业上具有极其重要的应用前景。建立一种高效的分离方法纯化表面活性素的方法具有重要的应用价值。 通常筛选到的一株高产表面活性素的枯草芽胞杆菌菌株，其还能分泌伊枯草素和泛革素，由于这三类脂肽类化合物的理化性质相近，因此不容易通过简单的纯化方法将表面活性素和伊枯草素、泛革素进行高效分离。 枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916是江苏省农业科学院20世纪90年代分离的生防菌，对水稻纹枯病具有很好的防治效果，已经成功进入商业化生产10多年，产生了巨大的经济效益。该菌株于2002年09月30日在中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC N0.0808。经过前期研究表明Bs916能分泌产生表面活性素、伊枯草素家簇的杆菌霉素L和泛革素三类脂肽抗生素，是Bs916具有抗真菌活性的关键因素。本专利技术通过构建基因突变株和色谱分离技术相结合建立一种从Bs916中分离纯化表面活性素的新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于:提供枯草芽胞杆菌抗菌脂肽表面活性素，以及一种枯草芽胞杆菌胞外抗菌脂肽表面活性素的分离纯化方法。 本专利技术的目的是这样实现的:枯草芽胞杆菌抗菌脂肽表面活性素，其特征在于:从枯草芽胞杆菌Bs916的杆菌霉素L和泛革素基因的双突变株BBFM的胞外产物中分离纯化后获得；通过电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定包含有分子量为1007.6、1021.7和1035.7等相差一个亚甲基(-CH2)的表面活性素同系物。 一种枯草芽胞杆菌胞外抗菌脂肽的分离纯化方法，其特征在于: a、以新霉素抗性基因和氯霉素抗性基因作为筛选标记基因，以杆菌霉素L和泛革素合成基因部分核酸序列作为单交换同源片段，构建敲除载体pUC19-ne0-bac和pSGl 164-Fen ;将构建的单交换载体依次转化至枯草芽胞杆菌Bs916，构建杆菌霉素L和泛革素基因簇双突变株BBFM。突变株BBFM合成杆菌霉素L和泛革素的能力丧失，只能分泌产生表面活性素。 b、将双突变株BBFM转接到LB培养液中，在28°C、180r/min条件下振荡培养72h，发酵液离心除去菌体，用浓盐酸调至pH2.0沉淀过夜。8000g离心25min得到沉淀,沉淀采用甲醇抽提，抽提物经0.22 μ mol.L-1微孔滤膜后，即为粗制备的表面活性素样品。 C、将粗提物采用去离子水稀释为含30%甲醇水溶液，pH值调至7.0，然后上样于NH2固相萃取柱,分别用含50%甲醇水溶液，100%甲醇,含0.5%甲酸甲醇溶液，1%甲酸甲醇溶液，2%甲酸甲醇溶液梯度洗脱。在紫外波长210nm处检测，其中在含1%甲酸甲醇洗脱溶液中检测到表面活性素。 d、将含1%甲酸甲醇洗脱溶液的pH值调至7.0，氮气吹干浓缩、再用去离子水稀释为30%甲醇水溶液，然后上样于C18固相萃取柱；采用梯度洗脱30%，50%，70%，90%甲醇水溶液洗脱。在紫外光0D210nm处检测，其中在含90%甲醇水洗脱溶液中检测到表面活性素。 e、将90%甲醇水洗脱溶液氮气吹干后再用去离子水稀释为40%甲醇水溶液，再上样于C18固相萃取柱；采用10倍柱体积的75%，80%，85%，90%，95%，100%甲醇水溶液梯度洗脱，其中在80^^85%洗脱液得到目标化合物表面活性素。合并80^^85%洗脱液氮气吹干浓缩后真空干燥，得到表面活性素的纯品。 f、提取的表面活性素采用Tri本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株枯草芽胞杆菌胞外脂肽抗生素表面活性素，其特征在于：从枯草芽胞杆菌胞外产物中分离纯化后获得；通过电喷雾四级杆飞行时间串联质谱测定，分子量为1007.6、1021.7和1035.7等相差一个亚甲基(‑CH2)的表面活性素同系物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗楚平，周华飞，陈志谊，王晓宇，刘永锋，刘邮洲，张荣胜，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32