蛋白质纯化中提高病毒去除的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质纯化领域。特别是本发明专利技术涉及通过在预过滤工艺中组合使用内毒素去除和阳离子交换基质，增加病毒滤器的过滤容量的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景专利
本专利技术属于蛋白质纯化的领域。特别是本专利技术涉及通过在预过滤工艺中组合使用内毒素去除和阳离子交换基质，增加病毒滤器的过滤容量的方法。相关技术的描述由于能够进行正确的蛋白质折叠和翻译后修饰(例如糖基化(Chu和RobinsonCurrent Opinion in Biotechnology 12:180 - 187，2001))的能力，哺乳动物细胞系已成为重组蛋白质生产技术的主要选择。然而，也已知这些细胞系含有逆转录病毒样颗粒(Lieber等人，Science 182:56 - 59，1973 ;Lubiniecki 等人，Dev Biol Stand 70:187 - 191, 1989),并存在潜在的外来病毒污染的风险(Garnick, Dev Biol Stand. Basel:Karger 93:21 - 29，1998)。虽然生物制药产业生产的重组蛋白质药物具有良好的安全性记录，但是也有由血液和源自血浆的血液产品造成的病毒感染发生(Brown, Dev. Biol. Stand. 81, 1993 ；Thomas, Lancet 343:1583-1584,1994)。为了减少在重组蛋白质生产过程中病毒污染的风险，设计下游的纯化工艺包括去除内源性和外来病毒的加工步骤。通过若干提供从原料流(process feed stream)中失活病毒或去除病毒的加工步骤的组合，获得充分的病毒清除。使用例如在低PH下孵育、热和去垢剂处理的技术实现病毒失活，同时通常使用层析和过滤实施病毒去除(Curtis 等人，Biotechnology and Bioengineering84 (2) : 179 - 186, 2003)。与基于物理化学性质(例如净电荷)去除病毒的层析基质不同，病毒过滤通过尺寸排阻去除病毒，因此被认为是更强效的技术。迄今为止，在源自哺乳动物细胞培养物的生物治疗剂的下游纯化过程中使用病毒过滤限于去除逆转录病毒(80-100nm直径)，这是因为缺少标称孔径小于60nm的高通量膜的结果。近期在膜技术中的进步使得能够生产标称孔径20nm的高通量膜。这些病毒滤器滞留细小病毒(18_26nm直径)，允许通过大至160kD的蛋白质Γ8ηπι)，例如单克隆抗体(mAb)o高选择性和高通量的细小病毒滤器是通过在微孔底物上覆盖一层薄的滞留膜层获得的。该薄的滞留层允许非常精细的分离蛋白质和病毒，但也易于被加工原料流中的杂质结垢，导致较低的过滤容量和流动。病毒滤器结垢归因于污染物，例如蛋白质聚集体和变性的蛋白质。Bohonak 和 Zydney (Bohonak and Zydney, Journal of MembraneScience254(l-2) :71-79, 2005)展示了滤器容量的丧失可能是由于滤饼形成或孔阻塞。其他近期的报道(Bolton 等人，Biotechnol. Appl. Biochem. 43:55-63，2006 ；Levy 等人，Filtration in the Biopharamaceutical Industry. (Meltzer, T. H.和 Jornitz, M. W.编著)第619-646页，Marcel Dekker, New York, 1998)将滤器结垢的可能原因归因于孔壁对杂质的吸附。一些出版物(Bolton 等人，Biotechnology and Applied Biochemistry42:133-142，2005 ；Hirasaki 等人，Polymer Journal 26(11):1244-1256, 1994 ；0mar 和Kempf,Transfusion 42(8) : 1005-1010, 2002)也证实过滤容量的降低或孔的堵塞可以使病毒滞留减少若干数量级，影响单位操作的耐用性(robustness)。因而，大量的近期研究关注了鉴别预滤器(pre-filter)，所述预滤器用于从加工原料流中去除污垢以最小化病毒滤器的污垢和保证高容量、高通量和耐用的病毒滞留。Bolton等人(Bolton等人，2006)实施了充分的研究，涉及测试若干种膜作为预滤器，并证实使用Viresolve 深度滤膜作为预滤器，能够使正常流量的细小病毒(NFP)膜的容量增加几乎一个数量级。Brown 等人(Brown 等人，2008，Use of Charged Membranes to IdentifySoluble Protein Foulants in order to Facilitate Parvovirus Filtration. IBC's20th Antibody Development and Production, San Diego, CA)评估了强阳离子交换膜吸附剂作为细小病毒滞留过滤器的预滤器，并展示了可以使11种不同的mAb流的病毒过滤容量增加若干倍。作者假设阳离子交换膜吸附剂通过竞争性吸附，从原料流中去除了大分子量r600-1500kD)的蛋白质聚集物，阻止病毒滤器堵塞。美国专利号7，118,675 (Siwak等人)描述了这样的工艺，所述工艺利用电荷修饰的膜从蛋白质溶液中去除蛋白质聚集物，防止病毒滤器结垢。专利技术概述 本专利技术是基于，至少部分地基于这样的实验发现，即细小病毒滤器的结垢可以是由除文献提及以外的杂质导致的，需要更综合的预过滤溶液来改善病毒过滤容量。因此，本专利技术提供了新的预过滤溶液，其性能显著优于文献中提及的最佳预过滤方法(阳离子交换膜吸附剂)。在一个方面，本专利技术涉及在蛋白质纯化过程中改善病毒滤器过滤容量的方法，包括在通过所述病毒滤器前，以任意顺序对包含待纯化的蛋白质的组合物进行阳离子交换步骤和内毒素去除步骤。在一个实施方案中，病毒滤器的孔径在约15和约IOOnm直径之间。在另一个实施方案中，病毒滤器的孔径在约15和约30nm直径之间。在仍然另一个实施方案中，病毒滤器的孔径是约20nm。在进一步的实施方案中，待去除的病毒是细小病毒。在仍然进一步的实施方案中，细小病毒的直径在约18和约26nm之间。在不同的实施方案中，蛋白质是抗体或抗体片段，例如通过重组DNA技术生产的抗体，或其片段。在另一个实施方案中，抗体是治疗性抗体。在仍然另一个实施方案中，重组抗体或抗体片段是在哺乳动物宿主细胞中生产的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在进一步的实施方案中，待纯化的包含蛋白质的组合物在病毒过滤前，首先进行阳离子交换步骤，再进行内毒素去除步骤。在仍然进一步的实施方案中，包含待纯化的蛋白质的组合物在病毒过滤前，首先进行内毒素去除步骤，再进行阳离子交换步骤。在另一个实施方案中，包含待纯化的蛋白质的组合物在病毒过滤前，同时进行阳离子交换步骤和内毒素去除步骤，将两种介质共同保持在单个模块中。在仍然另一个实施方案中，在内毒素去除步骤后直接进行病毒过滤。在进一步的实施方案中，在阳离子交换步骤后直接进行病毒过滤。在不同的实施方案中，在约4和约10之间的pH下实施病毒过滤。在另一个实施方案中，在待纯化的组合物中的蛋白质浓度是约l_40g/L。在仍然另一个实施方案中，待纯化的抗体是针对选自HERl (EGFR)、HER2、HER3、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.08.06 US 61/231,8111.在蛋白质纯化过程中改善病毒滤器过滤容量的方法，包括在通过所述病毒滤器前，同时或以任意顺序使待纯化的包含蛋白质的组合物进行阳离子交换步骤和内毒素去除步骤。2.权利要求I的方法,其中病毒滤器的孔径在直径约15和约IOOnm之间。3.权利要求2的方法，其中病毒滤器的孔径在直径约15和约30nm之间。4.权利要求3的方法，其中病毒滤器的孔径是约20nm。5.权利要求3或权利要求4的方法，其中待去除的病毒是细小病毒。6.权利要求5的方法，其中细小病毒的直径在约18和约26nm之间。7.权利要求I的方法，其中蛋白质是抗体或抗体片段。8.权利要求7的方法，其中蛋白质是重组抗体或抗体片段。9.权利要求8的方法，其中重组抗体或抗体片段是在哺乳动物宿主细胞中生产的。10.权利要求9的方法，其中哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。11.权利要求I的方法，其中待纯化的包含蛋白质的组合物在病毒过滤前，首先进行阳离子交换步骤，再进行内毒素去除步骤。12.权利要求I的方法，其中待纯化的包含蛋白质的组合物在病毒过滤前，首先进行内毒素去除步骤，再进行阳离子交换步骤。13.权利要求I的方法，其中待纯化的包含蛋白质的组合物在病毒过滤前，同步进行内毒素去除步骤和阳离子交换步骤。14.权利要求11的方法，其中在所述内毒素去除步骤后直接进行病毒过滤。15.权利要求12的方法，其中在所述阳离子交换步骤后直接进行病毒过滤。16.权利要求13的方法，其中在所述同步的内毒素去除和阳离子交换步骤后直接进行病毒过滤。17.权利要求I的方法，其中在约4和约10之间的pH下实施病毒过滤。18.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·梅塔，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：