本文提供用于将具有1型凝血酶敏感蛋白基序的重组A解整合素样金属肽酶13(ADAMTS13)蛋白质从样品中纯化的方法。所述方法包括在使得ADAMTS13蛋白质出现于由羟基磷灰石所得的洗脱液或上清液中的条件下，通过用色谱法使样品与羟磷灰石接触来使ADAMTS13蛋白质富集。所述方法可进一步包括使用结合ADAMTS13蛋白质的混合模式阳离子交换/疏水性相互作用树脂的串联色谱法。其它任选的步骤涉及超滤/渗滤、阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法和病毒灭活，本文还提供用于使蛋白质样品中的病毒污染物灭活的方法，其中将所述蛋白质固定于载体上。本文还提供根据所述方法制备的ADAMTS13的组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般来说涉及纯化具有1型凝血酶敏感蛋白基序的重组解整合素样金属肽酶13(ADAMTS13)和其它蛋白质的方法，以及包含此类纯化蛋白质的组合物。
技术介绍
金属蛋白酶基因家族，ADAM(解整合素金属蛋白酶)，包括具有不同功能的膜锚定蛋白酶成员。ADAMTS家族成员与ADAM的不同之处在于C末端有一个或多个凝血酶敏感蛋白1样(TSPl)域，并且没有通常在ADAM金属蛋白酶中观察到的EGF重复序列、跨膜域和胞质尾区。具有1型凝血酶敏感蛋白基序的解整合素样金属肽酶13 (ADAMTS13)是ADAMTS家族的一员。ADAMTS13具有八个凝血酶敏感蛋白域，并且没有疏水性跨膜域。因此，它被分泌。ADAMTS13 裂解血管性血友病因子(von Willebrand Factor)的 Tyr16ci5-Met16ci6 键，并且需要钙和锌离子以便发挥作用。ADAMTS13也称为“血管性血友病因子-裂解蛋白酶”和 "VffFCP"οADAMTS13表达不足已经与一些疾病，例如血栓性障碍，诸如血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的发病机理有牵连(参见，例如美国专利公布第20070015703号)。在TTP中， ADAMTS13的不足和/或受抑制导致整个身体的小血管中形成广泛的微观血栓(血栓性微血管病)。穿过微观血块的红细胞经受剪切应力，引起红细胞的细胞膜损伤，进而又导致血管内溶血和裂红细胞形成。血栓也引起血流量减少，从而可导致末梢器官损伤。症状通常包括神经学问题，诸如幻觉、行为怪异、精神状态改变、中风或头痛；肾功能衰竭；发烧；和导致瘀伤或紫癜的血小板减少(血小板计数低)；以及涉及贫血和黄疸的微血管溶血性贫血。 目前的疗法涉及用于减少针对ADAMTS13的循环抗体的血浆除去法，和/或补充所述酶在血液中的水平。因此，存在对提供用于纯化(特别是在商业生产规模上纯化)可用作治疗剂的重组ADAMTS13的方法的强烈需要。纯化ADAMTS13已被证明是困难的，并且已尝试包括色谱法的各种方法。结合非ADAMTS13蛋白质，而允许ADAMTS13蛋白质出现在洗脱液或上清液中的色谱材料将提供用于纯化的有用方法。结合ADAMTS13蛋白质，而使非ADAMTS13杂质留在溶液中或更加强烈地结合的色谱材料也提供引人注目的方法，并且可与其它方法一起串联使用。本公开提供此类方法。此外，病毒污染物也在ADAMTS13蛋白质以及其它蛋白质和重组蛋白质的纯化中造成难题。一种常规方法涉及用溶液形式的溶剂-清洁剂混合物处理待纯化的样品。样品与溶剂_清洁剂化学品一起培育导致脂质包衣病毒失活。然而，这种溶液内处理不能有效要求将样品转移到至少一个其它容器以便(例如)有助于在处理后清除溶剂-清洁剂化学品。此外，一些蛋白质(包括ADAMTS13)对溶剂_清洁剂化学品敏感，导致聚集物的形成。 本公开提供涉及在溶剂-清洁剂处理期间将蛋白质固定的方法以解决病毒灭活的此类问题。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及一种用于从包含ADAMTS13蛋白质和非ADAMTS13杂质的样品中纯化具有1型凝血酶敏感蛋白基序的重组解整合素样金属肽酶13(ADAMTS13)蛋白质(尤其人类ADAMTS13)的方法。已意外地发现，可在适合于从非ADAMTS13杂质中纯化 ADAMTS13蛋白质的条件下使用羟基磷灰石色谱法。所述方法包括在使得ADAMTS13蛋白质出现于由羟基磷灰石所得的洗脱液中的条件下，用色谱法使样品与羟基磷灰石接触来使 ADAMTS13蛋白质富集。也就是说，在使得ADAMTS13蛋白质，优选ADAMTS13蛋白质的实质性部分不与羟基磷灰石结合，而杂质得以保留的条件下，对样品进行羟基磷灰石色谱法。在一些优选实施方案中，从在培养包含重组ADAMTS13核酸的CHO细胞后所收集的上清液中纯化重组ADAMTS13蛋白质。在一些优选实施方案中，上清液或洗脱液中的收率百分比意外地为 50 %到100 %。所述方法可进一步包括串联色谱法，其包括用色谱法使由羟基磷灰石所得的洗脱液与结合ADAMTS13蛋白质的混合模式阳离子交换/疏水性相互作用树脂接触。在一些优选实施方案中，通过串联色谱法富集后的ADAMTS13收率百分比意外地为至少60%。在一些实施方案中，所述方法进一步包括任选的预富集制备步骤以浓缩样品中的 ADAMTS13和/或使ADAMTS13蛋白质与阴离子交换树脂结合。例如，所述方法可进一步包括在用色谱法与羟基磷灰石接触前，用色谱法使样品阴离子交换树脂接触并从阴离子交换树脂中洗脱ADAMTS13蛋白质；和/或在用色谱法与羟基磷灰石接触前，通过超滤来浓缩样品中的ADAMTS13蛋白质；和/或在用色谱法与羟基磷灰石接触前，通过渗滤交换到包含钙离子和锌离子的缓冲液中来使ADAMTS13蛋白质稳定。在一些优选实施方案中，在串联色谱法前，将样品通过10倍到20倍超滤来浓缩，使缓冲液通过具有30kDa截留分子量的渗滤来交换成含有钙和锌离子的低电导率缓冲液，并且使ADAMTS 13与阴离子交换树脂结合并从所述阴离子交换树脂中洗脱(诸如ANX Sepharose Fast Flow、POROS 50D，或POROS 50PI)。 在一些优选实施方案中，来自阴离子交换色谱步骤的洗脱液池是用羟基磷灰石稀释缓冲液以1 4稀释来使电导率降低至6mS/cm，然后进行羟基磷灰石串联色谱法，其包括羟基磷灰石色谱法，接着使用由羟基磷灰石所得的洗脱液，以结合ADAMTS13蛋白质的混合模式阳离子交换/疏水性相互作用树脂来进行色谱法。在一些优选实施方案中，来自预富集步骤的洗脱液可意外地提供至少75%的收率百分比。在一些实施方案中，在用色谱法与羟基磷灰石或混合模式树脂接触后，所述方法进一步包括通过阳离子交换色谱法来进行的任选精炼步骤。在此类实施方案中，在与羟基磷灰石或阳离子交换/疏水性相互作用树脂接触后，所述方法可进一步包括通过降低缓冲液电导率来制备ADAMTS13蛋白质以便进行阳离子交换的步骤。在一些实施方案中，此制备步骤是通过超滤/渗滤、渗析和/或凝胶过滤来进行。在一些实施方案中，当使用超滤/渗滤时，截留量为lOkDa。在一些实施方案中，缓冲液更换是通过ANX琼脂糖凝胶-FF低取代度的阴离子交换色谱法来进行。在使用渗析的一些实施方案中，渗析可由通过单个渗析模块的不超过2次操作组成。在一些优选实施方案中，阳离子交换色谱法是在Source S柱或 POROS S柱上进行。在一些优选实施方案中，降低缓冲液电导率后的ADAMTS 13收率百分比意外地为至少90%，并且通过阳离子交换色谱法精炼后的ADAMTS13收率百分比意外地为至少70%。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对ADAMTS13蛋白质进行任选的病毒灭活步骤(例如)以使病毒失活和/或清除病毒和病毒颗粒。在一些实施方案中，病毒灭活步骤包括将包含非离子型清洁剂和有机溶剂的溶剂_清洁剂混合物添加至ADAMTS13蛋白质。在一些优选实施方案中，将ADAMTS13蛋白质固定，例如，固定于阳离子交换树脂上。在一些实施方案中，溶剂-清洁剂混合物包含1%TRIT0NX-100、0. 3%磷酸三正丁酯，和0. 3% 吐温80 ；且/或溶剂_清洁剂处理在12°C到1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·哈斯拉赫尔，A·米特雷尔，C·菲德勒，C·迈尔，
申请(专利权)人：巴克斯特保健股份有限公司，巴克斯特国际公司，
类型：发明
国别省市：
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