本发明专利技术公开了一种柯萨奇病毒A16＿3C蛋白酶的结构及其应用，属于RNA病毒蛋白质领域。本发明专利技术还公开了一种利用3C蛋白酶及其底物结合槽在药物设计中的应用。本发明专利技术提供的蛋白质具有特殊的底物结合槽，可根据其底物结合槽的空间结构设计新型抗CVA16病毒3C蛋白酶药物，进而获得更特异的、效果更好的针对CVA16病毒3C蛋白酶的抑制剂，从而为临床治疗手足口病提供潜在的备选药物，具有很高的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种3C蛋白酶的结构及其应用，尤其是一种具有独特底物结合槽的柯萨奇病毒A16 (CVA16) 3C蛋白酶。
技术介绍
柯萨奇病毒A16 (CVA16)是最常见的引起小儿手足口病的致病原之一。手足口病近些年在世界范围内，尤其是东亚地区(中国大陆，台湾，日本等)的爆发流行，导致了巨大的生命财产和经济损失。目前尚没有行之有效的预防和治疗手段。CVA16编码一个病毒特异的蛋白酶叫3C蛋白酶。该蛋白酶可以将病毒编码的多聚蛋白前体加工成功能性的蛋白亚基，因而在病毒的复制和生命周期中发挥着重要作用。而在人类中缺少该蛋白酶的同源蛋白，因此能抑制该蛋白酶活性的化合物能有效抑制病毒的复制，进而成为治疗手足口病的方法之一。目前，特异性针对CVA16病毒3C蛋白酶的抑制剂分子仍然匮乏。利用高分辨率的病毒3C蛋白酶的晶体结构，寻找可与之特异性结合的小分子，或者对已知化合物进行以结构为基础的改造进而获得活性更高的化合物，已成为药物筛选的有效手段。目前还没有CVA16病毒3C蛋白酶的晶体结构。在目前已报道的有晶体结构的3C蛋白酶中，与CVA16病毒3C蛋白酶序列上相似性最高的是鼻病毒(HRV)和柯萨奇病毒B3(CVB!3)的3C蛋白酶，彼此间的序列相似度也只有50%左右。与之相应，虽然这三种病毒均属于小RNA病毒科肠病毒属，但HRV属于人类鼻病毒种，CVB3属于人类肠病毒B种，而CVA16归于人类肠病毒A种。因此以HRV或CVB3病毒的3C蛋白酶结构为基础模建的CVA16-3C蛋白酶结构与真实结构间可能存在较大的差异，也使得筛选特异性针对CVA16病毒3C蛋白酶的抑制剂分子难以实现。因此获得大量有活性、高纯度的CVA16-3C蛋白酶，进而解析其晶体结构，从而为后续的抑制剂筛选提供结构依托，是目前急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种柯萨奇病毒A16 (CVA16) 3C蛋白酶的结构。所述3C蛋白酶为如(a)或(b)或(c)的蛋白质(a)有SEQID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有3C 蛋白酶活性的由(a)衍生的蛋白质，(c)与(a)中氨基酸序列整体相似度在85%以上，并且在R39，K130,H24，Q19，E107和 H108等六个位置上氨基酸完全保守的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种所述3C蛋白酶结构在药物设计中的应用，尤其是在药物分子设计中的应用。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种所述蛋白酶的底物结合槽。所述底物结合槽氨基酸组成及空间排布如SEQ ID NO. 2和图5D所示，其S2位点为半封闭的槽状结构，Si，位点的容积显著变小。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种所述底物结合槽在药物设计中的应用，尤其是在药物分子设计中的应用。本专利技术首次获得了柯萨奇病毒A16 (CVA16) 3C蛋白酶的晶体结构，在晶体结构的基础上，发现了其底物结合槽的特殊性，为以此结合槽为靶点的小分子抑制剂设计提供了结构基础。附图说明图1 CVA16 3C蛋白酶的分子筛图谱黑线为280nm吸收值，红线为^Onm吸收值，两者的比值在1. 5左右，表明目的蛋白中没有核酸类污染，图中出峰处各收集样品4-16号进一步以SDS-PAGE分析。图 2 CVA16 3C 蛋白酶 SDS-PAGE 图谱各泳道对应分子筛图谱中的4-16号收集样品，#表示低分子量蛋白Marker。图3 CVA16 3C蛋白酶的体外活性检测A:底物，B:底物+CVA16-3C-C147A, C:底物+CVA16-3C。图4 CVA16-3C蛋白酶的晶体结构。图5 CVA16-3C蛋白酶的底物结合槽。A: 底物多肽(序列FAGLRQAVTQ)+ CVA16-3C的复合物结构 B: AG7088+CVA16-3C的复合物结构C:底物结合槽D:底物结合槽空间结构。图 6 AG7088 结构式八-已分别代表？1，，？1，卩2，？3，卩4各基团。图7 CVA16-3C蛋白酶和HRV-3C蛋白酶S2位点比较 A: CVA16-3C 的 S2 位点，B: HRV-3C 的 S2 位点。图8 CVA16-3C蛋白酶Si，位点图9 CVA16-3C+AG7088的复合物结构及其与HRV-3C+AG7088结构的比较。具体实施例方式实施例1 CVA16 3C蛋白酶的获得我们成功体外表达了 CVA16病毒的3C蛋白酶，并通过亲和层析和分子排阻层析获得高纯度、有活性的酶蛋白。CVA16 3C蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或SEQ ID NO. 1所示序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有3C蛋白酶活性的由SEQ ID NO. 1氨基酸序列衍生的蛋白质。蛋白质的序列SEQ ID NO. 1 GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAILPRHSQPGKTIWVEHKLINVLDAVELVDEQGVNLELTLVTLDTNEKFRDVTKFIPETITGASDATLIINTEHMPSMFVPVGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGG VVTSVGKIIGIHIGGNGRQGFCAGLKRGYFASEQ 1.质粒构建我们将编码3C蛋白酶的DNA片段人工全合成，用Ndel和)(h0l酶切位点连入pET_21a 载体中，并在酶蛋白的编码片段后插入6组氨酸标签(hexa-His-tag)的编码序列，然后为翻译终止密码子，如此则在诱导蛋白表达后，会得到一个带有C-端组氨酸标签的重组蛋白，利于后续的蛋白纯化。此DNA片段全序列如下catatgGGTCCGTCTCTGGACTTCGCGCTGTCTCTGCTGCGTCGTAACATCCGTCAGGTTCAGACCGACCAA GGACATTTTACTATGTTAGGAGTGCGAGATCGCCTAGCTATTTTGCCACGCCACTCGCAACCAGGAAAAACTATTTG GGTGGAGCACAAGTTAATCAATGTATTGGATGCTGTTGAATTGGTGGATGAGCAAGGTGTAAACTTGGAACTCACAC TAGTAACCTTGGACACCAACGAAAAGTTTAGGGATGTCACCAAGTTTATTCCAGAGACGATCACCGGGGCAAGCGAC GCAACCTTGATCATCAACACTGAGCACATGCCCTCAATGTTCGTTCCAGTGGGCGATGTTGTACAATATGGGTTTCT AAACCTCAGCGGTAAGCCCACACACCGAACCATGATGTACAATTTCCCCACAAAGGCAGGACAGTGTGGAGGTGTGG TCACCTCAGTCGGCAAGATTATTGGAATTCATATCGGTGGGAATGGTCGCCAAGGTTTCTGTGCTGGACTGAAGAGA GGTTACTTTGCCAGTGAACAGCACCACCACCACCACCACTGActcgag 该蛋白的氨基酸序列如下MGPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAIL本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种柯萨奇病毒Ａ１６＿３Ｃ蛋白酶的结构，其特征在于其氨基酸组成如（ａ）或（ｂ）或（ｃ）的蛋白质：（ａ）有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示的氨基酸组成的蛋白质，（ｂ）在（ａ）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有３Ｃ蛋白酶活性的由（ａ）衍生的蛋白质；（ｃ）与（ａ）中氨基酸序列整体相似度在８５％以上，并且在Ｒ３９，Ｋ１３０，Ｈ２４，Ｑ１９，Ｅ１０７和Ｈ１０８等六个位置上氨基酸完全保守的由（ａ）衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种柯萨奇病毒A16 — 3C蛋白酶的结构，其特征在于其氨基酸组成如(a)或(b)或 (c)的蛋白质(a)有SEQID NO. 1所示的氨基酸组成的蛋白质，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有3C 蛋白酶活性的由(a)衍生的蛋白质；(c)与(a)中氨基酸序列整体相似度在85%以上，并且在R39，K130,H24，Q19，E107和 H108等六个位置上氨基酸完全保守的由(a)衍生的蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：高福，逯光文，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11
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