用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤：（１）菠萝蛋白酶的提取；（２）冷凝聚；（３）游离出菠萝蛋白酶；（４）固态酶制剂制备等步骤。本发明专利技术的优点在于：（１）由于聚丙烯酸无毒性，用聚丙烯酸制备的菠萝蛋白酶无污染，其纯度高，活性好，可直接作为医疗原料应用；（２）聚丙烯酸原料来源方便，可用于工业化大规模生产；（３）本发明专利技术方法操作简单，快速、高效，分离量大。

Process for preparing bromelain from high molecular compound polyacrylic acid

The present invention provides a method for preparing polyacrylate bromelain, which comprises the following steps: (1) extraction of bromelain; (2) cold condensation; (3) free of bromelain; (4) solid enzyme preparation. The invention has the advantages that: (1) the polyacrylic acid non-toxic, polyacrylic acid preparation of bromelain and no pollution, the high purity, good activity, can be directly used as raw materials for medical applications; (2) polyacrylic acid convenient raw material source, and can be used for industrial mass production; (3) the method of the invention has the advantages of simple operation. Fast, efficient, large amount of separation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及菠萝蛋白酶制备方法，具体地，涉及。
技术介绍
高分子化合物聚丙烯酸(Polycrylic Acid，縮写PAA)是以丙烯酸为单位聚合而 成，其结构式为 聚丙烯酸为无色或淡黄色液体，易溶于水，能与金属离子、钙、镁等形成稳定的化 合物，对水中碳酸钙和氧化钙有优良的分解作用，对人畜无毒，工业上常用作分散剂。其价 格便宜(岳6200元/吨)易得，质量指标符合GB/T1053-2000。 菠萝蛋白酶(Bromelain)，简称菠萝酶，也称为凤梨酶或凤梨酵素，酶学编号 EC3. 4. 22. 32，是从凤梨科(Ananas comosus)植物中提取制备而得一种纯天然植物蛋白质。 菠萝蛋白酶是一类巯基蛋白酶，其活性中心为巯基(-SH)，具很强的水解活性，能进行蛋白 质水解等各种生化反应，还具有很强的分解纤维蛋白和血凝块的作用，可提高人体免疫力， 因而，被广泛的用于食品、生物、医药和化工等行业。 目前，菠萝蛋白酶的提取方法，主要有化学提取法和物理提取方法，如专利 CN1908165A提供了一种菠萝蛋白酶物理提取新方法，其提取菠萝蛋白酶的工艺步骤为原 料_清洗_粉碎_预处理_榨汁_离心_冷冻_过滤_超滤_干燥_成品，整个工艺能耗 巨大，生产工艺复杂繁琐，成本高，不利于规模化生产，其菠萝蛋白酶产品得率较低。专利 CN100368537C提供了一种菠萝蛋白酶冷冻干燥粉的制备方法，菠萝原料经清洗榨汁后，滤 液用氧化锌吸附，超滤浓縮液，冷冻干燥等步骤制得菠萝蛋白酶冷冻干燥粉，其酶活性单位 达到600万单位/g，可作为医药原料使用，该工艺较为简单，易于操作，但其产物酶活性太 低，工艺中使用的材料昂贵，不经济。专利CN101307309A提供了一种利用金属螯合亲和膜 提纯菠萝蛋白酶的方法，活化的尼龙膜经改性后，螯合金属锌离子，吸附菠萝蛋白酶，而后 洗脱即可。该法需对尼龙膜处理工艺复杂，整个工艺耗时长，终产品纯化倍数低。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术之不足，提供一种用高分子化合物聚丙烯酸制备菠 萝蛋白酶的方法，该法原料低廉易得，操作简便，菠萝蛋白酶得率高，纯化倍数高，酶活性 好。 本专利技术的技术方案如下，包括 如下步骤 (1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝果皮或茎叶，洗净；加入含4 6mmol/L焦亚硫 酸钠和1 5mmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比为 5 : 1. 5 2. 5，匀浆；过滤得滤液；3500 4000r/min，离心滤液，收集上清液，即得菠萝蛋 白酶提取液； (2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入0. 5 0. 8%的聚丙烯 酸(PAA)后，置于4 8t:冷凝聚12 14小时；3500 4000r/min，离心，收集沉淀，即为 聚丙烯酸-菠萝蛋白酶； (3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白酶 中，加入可以溶解沉淀量的50 60mmol/L醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙 烯酸-钙沉淀；3500 4000r/min，离心，上清液即为菠萝蛋白酶液，沉淀为聚丙烯酸-钙； (4)固态酶制剂制备向步骤(3)所得菠萝蛋白酶液中加入1/15mol/L， p朋.8的 磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液，4 『C透析8 12小时；取出透析后的菠萝蛋白酶液， 冷冻干燥，即得菠萝蛋白酶固体酶制剂。 较佳地，步骤(1)所述菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比5 : 2。 步骤(1)所述过滤为用用200目尼龙过滤。 步骤(1)所用的菠萝果皮或茎叶，洗净后，切碎成2-3cm的小块。 向步骤(3)所述聚丙烯酸_钙沉淀中加入沉淀体积2%的硫酸，即生成硫酸钙和聚丙烯酸；3500 4000r/min，离心，沉淀为硫酸钙，上清液为聚丙烯酸(PAA)，回收聚丙烯酸，重复利用。 步骤(4)所述透析过程中，更换缓冲液一次。 本专利技术所提供的用高分子凝聚物制备菠萝蛋白酶的方法，其原理如下 PAA+E —PAA-E PAA_E+Ca2+ — PAA-Ca+E PAA-Ca+S042+ — CaS04+PAA 其中，PAA是聚丙烯酸的縮写，E代表菠萝蛋白酶，PAA-E代表聚丙烯酸_菠萝蛋白 酶，PAA-Ca代表聚丙烯酸_牵丐。 本专利技术的优点在于(l)由于聚丙烯酸无毒性，用聚丙烯酸制备的菠萝蛋白酶无 污染，其纯度高，活性好，可直接作为医疗原料应用；(2)聚丙烯酸原料来源方便，可用于工 业化大规模生产；(3)本专利技术方法操作简单，快速、高效，分离量大。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。 实施例1 ，包括如下步骤 (1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝果皮500克，洗净，切碎成2 3cm小块；加入含 4mmol/L焦亚硫酸钠和5mmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，切碎后的菠萝果皮或茎叶与水溶 液的固、液质量比为5 : 1.5，匀浆；用200目尼龙布过滤并挤出滤液；3500r/min，离心10 分钟，收集上清液，即得菠萝蛋白酶提取液，共计155ml ; (2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入O. 5%的聚丙烯酸(PAA) 后，搅拌均匀，置于4t:冷凝聚12小时；3500r/min，离心10分钟，收集沉淀，即为聚丙烯 酸-菠萝蛋白酶； (3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白 酶中，加入可以溶解沉淀量的50mmol/L醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙烯酸-钙沉淀；3500r/min，离心10分钟，上清液即为菠萝蛋白酶液，共计145ml，沉淀为聚丙 烯酸_钙；向所述聚丙烯酸_钙沉淀中加入沉淀体积2%的硫酸，即生成硫酸钙和聚丙烯 酸；3500r/min，离心10分钟，沉淀为硫酸钙，上清液为聚丙烯酸(PAA)，回收聚丙烯酸，重复 利用。 (4)固态酶制剂制备向步骤(3)所得菠萝蛋白酶液中加入1/15mol/L， p朋.8的 磷酸氢二钠_磷酸二氢钠缓冲液，4t:透析8小时；取出透析后的菠萝蛋白酶液，冷冻干燥， 即得菠萝蛋白酶固体酶制剂，共计2. 5g。 为了进一步说明本专利技术的所提供方法的效果，用常规方法检测各产物酶活性和蛋 白质含量并计算相关参数，其结果如表1所示 表1菠萝果皮所含菠萝蛋白酶分离纯化后酶活性和蛋白含量测定结果 <table>table see original document page 5</column></row><table> 实施例2 ，包括如下步骤 (1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝茎叶500克，洗净，切碎；加入含6mmol/L焦亚硫酸 钠和lmmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，切碎后的菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比 为5 2，匀浆；用200目尼龙布过滤并挤出滤液；4000r/min，离心10分钟，收集上清液，即 得菠萝蛋白酶提取液，共计155ml ; (2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入O. 8%的聚丙烯酸(PAA) 后，搅拌均匀，置于4 8t:冷凝聚12 14小时；4000r/min，离心10分钟，收集沉淀，即为 聚丙烯酸-菠萝蛋白酶； (3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：　　（１）菠萝蛋白酶的提取：取菠萝果皮或茎叶，洗净；加入含４～６ｍｍｏ　ｌ／Ｌ焦亚硫酸钠和１～５ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺乙酸钠的水溶液，菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比为５∶１．５～２．５，匀浆；过滤得滤液；３５００～４０００ｒ／ｍｉｎ，离心滤液，收集上清液，即得菠萝蛋白酶提取液；　　（２）冷凝聚向上述步骤（１）所得菠萝蛋白酶提取液中加入０．５～０．８％的聚丙烯酸后，置于４～８℃冷凝聚１２～１４小时；３５００～４０００ｒ／ｍｉｎ，离心，收集沉淀，即为聚丙烯酸－菠萝蛋白酶；　　（３）游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收：向步骤（２）所得聚丙烯酸－菠萝蛋白酶中，加入可以溶解沉淀量的５０～６０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙烯酸－钙沉淀；３５００～４０００ｒ／ｍｉｎ，离心，上清液即为菠萝蛋白酶液，沉淀为聚丙烯酸－钙；　　（４）固态酶制剂制备：向步骤（３）所得菠萝蛋白酶液中加入１／１５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ６．８的磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液，４～８℃透析８～１２小时；取出透析后的菠萝蛋白酶液，冷冻干燥，即得菠萝蛋白酶固体酶制剂。...

【技术特征摘要】
用高分子化合物聚丙烯酸制备菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)菠萝蛋白酶的提取取菠萝果皮或茎叶，洗净；加入含4～6mmo l/L焦亚硫酸钠和1～5mmol/L乙二胺乙酸钠的水溶液，菠萝果皮或茎叶与水溶液的固、液质量比为5∶1.5～2.5，匀浆；过滤得滤液；3500～4000r/min，离心滤液，收集上清液，即得菠萝蛋白酶提取液；(2)冷凝聚向上述步骤(1)所得菠萝蛋白酶提取液中加入0.5～0.8％的聚丙烯酸后，置于4～8℃冷凝聚12～14小时；3500～4000r/min，离心，收集沉淀，即为聚丙烯酸-菠萝蛋白酶；(3)游离出菠萝蛋白酶及聚丙烯酸回收向步骤(2)所得聚丙烯酸-菠萝蛋白酶中，加入可以溶解沉淀量的50～60mmol/L醋酸钙，使菠萝蛋白酶游离出来，同时生成聚丙烯酸-钙沉淀；3500～4000r/min，离心，上清液即为菠萝蛋白酶液，沉淀为聚丙烯酸-钙；(4)固态酶制剂制备向步骤(3)所得菠萝蛋白酶液中加入1/15mol/L，pH6.8的磷酸氢二钠-磷酸二氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋秋兰，
申请(专利权)人：宋秋兰，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]