本发明专利技术公开了一种灵芝细胞固定化方法，其具体步骤为：（１）制备固定化细胞载体：取人造海绵、玉米芯或丝瓜瓤，洗净，１２１℃灭菌４５～６０ｍｉｎ，无菌保存备用；（下述步骤在无菌条件下进行）（２）灵芝细胞斜面培养：接种灵芝细胞到斜面培养基上，２５～２８℃，培养７～９天，形成种子菌；（３）种子菌扩大培养：收集种子菌，接种到装２５０～３５０ｍｌ培养液的５００ｍｌ三角瓶、或装１１００～１４００ｍｌ培养液的２０００ｍｌ三角瓶，２５～２８℃下，以１００～１３０ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养８～１０天，形成菌液；（４）用衡重法测定细胞干质量达到０．７～１．０ｍｇ／ｍｌ；（５）按培养液体积：载体干质量为８～１０ｍｌ∶１～１．５ｍｇ，加入备用载体；（６）以１００～１３０ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养８～１２小时，细胞被固定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物细胞固定方法，具体地，涉及。技术背景灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr. )Krast.)属于担子菌纲、多孑L菌科、灵 芝属高等真菌。中华传统医学认为，灵芝味甘、性温、无毒、可补心、肝、肺、脾、肾五胀之气， 具滋补强壮、固本扶正之功效。现代医学研究也表明，灵芝的药理成分非常丰富，其中有效 成份包括多糖类(即灵芝多糖)、三萜类(主要为灵芝酸类)、灵芝多肽、16种氨基酸(其 中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、留类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延 胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn、等。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病 种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠 以及衰老的防治作用十分显著。其主要有效成份为灵芝多糖、灵芝酸具有抗癌和抗艾滋病 等疗效(Russell R，Paterson Μ. (2006)Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory. PHytochemistry67:1985-2001 ；Kun-Chieh Cheng,Hsuan-Cheng Huang,Jenn-Han Chen，et al. (2007)Ganoderma lucidum polysaccharides in human monocytic leukemia cells from geneexpression to network construction. BMC Genomics. 8 :411. ；El-MekkawyS, Meselhy MR， Nakamura N， Tezuka Y， Hattori M， Kakiuchi N， ShimotohnoK， Kawahata T， Otake T. (1998)Anti-HIV 1 and anti-HIV-l-protease substances fromGanoderma lucidum. PHytochemistry49 :1651-1657)。在灵芝多糖、灵芝酸的药用价值被广泛揭示的同时，灵芝产量和质量成为限制其 应用的瓶颈。目前灵芝的主要来源一是采集野生灵芝，二是人工栽培。野生灵芝数量稀少， 采集困难，价格高昂，难以广泛应用。人工栽培灵芝的生长期很短，先天不足，菌种抗病毒能 力差，农药的大量使用，基料的变化等，使目前的人工栽培灵芝往往是有其形而无其实。目前也发展了利用发酵方法产生灵芝多糖和灵芝酸等有效成份的方法，主要采用 液体深层发酵。如公开号为CN1264743A(专利技术名称液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝 酸的工艺)、CN1375557A(专利技术名称生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方 法)、授权公告号为CN1141392C(专利技术名称中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法)、 公开号为101235393A(专利技术名称促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的发酵方法)等专利文 献公开了一系列通过液体深层发酵产生灵芝多糖和灵芝酸的方法。但液体深层发酵是采用 游离细胞生产灵芝糖和灵芝酸，细胞密度低，产物含量和产量低，这正是灵芝多糖和灵芝酸 生产行业的瓶颈。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种灵芝细胞固定化方 法，与游离细胞发酵相比，提高了细胞密度，增加了产物含量和产量，增强细胞耐受毒害能 力，易于分离细胞和产物，可反复利用，发酵周期长。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种灵芝细胞固定化 方法，包括以下步骤(1)固定化细胞载体的制备取人造海绵或玉米芯或丝瓜瓤，洗净，在121°C灭菌 45 60min，保存备用；(2)灵芝细胞斜面的培养无菌条件下，将灵芝细胞接种到斜面培养基上，在25 培养7 9天，形成种子菌；(3)种子菌扩大培养在无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液250 350ml的500ml三角瓶中或装无菌培养液1100 1400m的2000ml三角瓶中，在25 下以100 130r/min摇瓶培养8 10天，形成菌液；(4)用衡重法测定细胞干质量达到0. 7 1. Omg/ml ；(5)按培养液体积与载体干质量的比例为8 IOml 1 1. 5mg，在无菌条件下 向菌液中加入备用载体；(6)以100 130r/min摇瓶培养8 12小时，细胞被固定。本专利技术灵芝细胞固定化方法中，按衡重法测定细胞固定化效率为70 85%。本专利技术灵芝细胞固定化方法中，所述灵芝选用紫芝(Ganoderma Sinense) YTZ9kICGMCC No. 0742。本专利技术灵芝细胞固定化方法中，所述斜面培养基为马铃薯培养基。本专利技术灵芝细胞固定化方法中，所述灵芝细胞斜面菌种的培养基为马铃薯 150 250g、琼脂18 22g、蛋白胨0. 1 0. 3g、葡萄糖15 25g、磷酸二氢钾0. 2 0. 4g、 硫酸镁0. 1 0. 2g、维生素B1O. 06 0. lg，加水至1000ml,自然pH，灭菌。本专利技术灵芝细胞固定化方法中，所述种子菌的液体培养基为黄豆30 60g、玉米 8 12g、蔗糖8 12g、硫酸镁0. 3 0. 5g、蛋白胨3 5g、葡萄糖8 12g、磷酸二氢钾 1. 2 1. 6g、氯化钙0. 1 0. 3g，先将黄豆和玉米勻浆后配料，加水定容至1000ml，自然pH， 灭菌。本专利技术为工业化高效发酵生产灵芝多糖提供了一种新的方法。本专利技术采用人造 海绵，玉米芯或丝瓜瓤作为细胞固定化的载体，原料来源丰富，易于加工，价格低廉，绿色环 保，固定化工艺简单，固定化效率高，按衡重法测定细胞固定化效率，并按下式计算细胞固定化效率(%)=酸臓軒膽-謝腫*10"。固定前细胞干质量可得灵芝细胞固定化效率可达70 85%，细胞固定后，发酵液中多糖含量可达 10-13%，比游离细胞发酵后的发酵液中多糖含量提高了 3-4倍。具体实施方式以下将结合具体实施例对本专利技术有关细节做进一步的说明。实施例1(1)人造海绵固定化细胞载体的制备取孔径0.75mm的人造海绵，洗净，切成 0. 3cm3，121 °C灭菌 50min,保存备用。(2)灵芝细胞斜面培养无菌条件下，将紫芝(Ganoderma Sinense) YTZ9kl4CGMCCNo. 0742细胞接种到斜面培养基上，25 ，培养8天，形成种子菌备用。其中，斜面 培养基中含有马铃薯200g/L、琼脂20g/L、蛋白胨0. 2g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾0. 3g/ L、硫酸镁 0. 15g/L、维生素 B1O. 08g/L。(3)种子菌扩大培养无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液300ml的 500ml三角瓶，25 下，以100 130r/min摇瓶培养8 10天，形成菌液。其中，种子 菌的培养液含有黄豆45g/L、玉米10g/L、蔗糖10g/L、硫酸镁0. 4g/L、蛋白胨4g/L、葡萄糖 10g/L、磷酸二氢钾1. 4g/L、氯化钙0. 2g/L。(4)用衡重法测定细胞干质量达到1. Omg/ml，则可计算得到固定前细胞干质量为 300mgo(5)按培养液体积与载体干质量的比例为9ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种灵芝细胞固定化方法，其特征在于包括以下步骤： （１）固定化细胞载体的制备：取人造海绵或玉米芯或丝瓜瓤，洗净，在１２１℃灭菌４５～６０ｍｉｎ，保存备用； （２）灵芝细胞斜面的培养：无菌条件下，将灵芝细胞接种到斜面培养基上，在２ ５～２８℃培养７～９天，形成种子菌； （３）种子菌扩大培养：在无菌条件下，收集种子菌，接种到装无菌培养液２５０～３５０ｍｌ的５００ｍｌ三角瓶中或装无菌培养液１１００～１４００ｍ的２０００ｍｌ三角瓶中，在２５～２８℃下以１００～１３０ｒ ／ｍｉｎ摇瓶培养８～１０天，形成菌液； （４）用衡重法测定细胞干质量达到０．７～１．０ｍｇ／ｍｌ； （５）按培养液体积与载体干质量的比例为８～１０ｍｌ∶１～１．５ｍｇ，在无菌条件下向菌液中加入备用载体； （６）以１００～１ ３０ｒ／ｍｉｎ摇瓶培养８～１２小时，细胞被固定。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋秋兰，
申请(专利权)人：宋秋兰，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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