一种固定化纳豆菌发酵木豆种子的方法技术

本发明专利技术涉及一种固定化纳豆菌发酵木豆种子的方法，并具体公开了其操作步骤，如下：首先分别采用吸附法、包埋法和交联法固定化纳豆菌，并通过液体培养发酵木豆种子制备成纳豆激酶和木豆种子发酵体系，然后选择最优的固定化方法并对其固载基质和发酵工艺条件进行优化和筛选，使用优化后的固定化菌球液体培养发酵木豆种子，最后得到富含纳豆激酶的发酵液和发酵木豆种子粉末。该发明专利技术不但能制备出具有溶血栓功效的保健功能食品，而且固定化后的纳豆菌易于分离，避免了人体直接摄入纳豆菌，同时固定化的菌球还可以重复使用，降低了发酵成本，实现了环保节能的生产方式，因此本发明专利技术具有广阔的市场前景和食品工业化生产应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食品科学
，具体涉及。
技术介绍
随着人们生活、饮食习惯的改变，血栓性疾病已成为一类严重危害人类健康和生命的疾病，其发病率、致残率和死亡率都很高。目前市场上各类溶栓降脂类药物琳琅满目，但治愈效果不堪预期，长期服用会引起人体的耐药性，以致治疗效果下降、医疗消费随之提高。因此，市场急需一类能够具有辅助治疗、无副作用、经济有效的药食同源保健功能食品的问世。为了开发上述食品，我们考虑采用固定化技术包埋菌体，制备发酵产品供人们解决血栓疾病问题。固定化技术是利用物理或者化学方法，将游离的微生物细胞或酶定位于设定的空间区域并维持其原有活性，使之成为连续流动的生物反应器且可反复使用的一种生物技术。目前，这项技术在啤酒、葡萄酒、果酒等领域的文献报道已经较为多见，在污泥、废水的处理方面应用较广。与传统的游离发酵相比，固定化技术具有高细胞密度、高发酵速率、产物与细胞易分离、固定化细胞重复利用率高且有望实现连续化生产等特点。目前固定化方法按照固定载体与作用方式的不同，可分为3种类型:吸附法(载体结合法)、包埋法、交联法(架桥法)。在实际应用中上述三种方法常常结合起来使用，并以吸附法和包埋法的应用较为普遍。现阶段已有多种载体被应用于固定化技术，其中海藻酸钠具有价廉易得、安全无毒、固定化操作简单、反应条件温和等优点，采用海藻酸钠制备的小球还具有较高的传质性能与生物活性，因此海藻酸钠是目前研究应用最广的包埋剂之一。采用海藻酸盐包埋微生物发酵适合的基质，制备具有溶血栓功能的体系。纳豆作为由黄豆经纳豆菌发酵制成的已开发保健功能食品，主要活性成分为激酶及菌代谢物，且其具有的溶血栓功能已得到实验验证和临床应用并在国际范围内风靡。木豆[CajanysCajan(L)Millsp.]作为唯一可食用的木本食用经济作物，不但含有非常丰富的淀粉、蛋白，且其油脂含量比黄豆少，更利于发酵菌体的生长和代谢。加之其独特含有的木豆芪酸抗癌成分和自身具有的多种药理功效，制备木豆发酵产品必将具有更好的市场应用前景。本专利技术采用海藻酸钠为载体来包埋纳豆菌，发酵液体木豆种子培养基，制备出具有良好溶栓活性的纳豆激酶和木豆种子发酵体系，有效地将固定化技术与生产功能保健性食品相结合起来，可实现安全无毒、环保节能的可持续工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术完成了对纳豆菌固定化方法的筛选，包括活性炭、硅胶等为基材的物理吸附法，DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素等为基材的离子结合法，海藻酸钙、聚乙烯醇、明胶等为基材的凝胶包埋法和戊二醛交联法，确定了采用海藻酸钠-氯化钙凝胶微球固定化纳豆菌。本专利技术对所选海藻酸钠-氯化钙凝胶微球固定化方法的固载基质进行了优化，确定了海藻酸钠和氯化钙溶液的浓度分别为6.(Γ8.0%、2.(Γ3.0%，制备出稳定性和活力良好的固定化纳豆菌菌球。本专利技术对海藻酸钠-氯化钙凝胶微球法固定化纳豆菌发酵木豆种子的发酵工艺条件进行了优化研究，单因素包括:料液比、pH、温度、接菌量、摇床转速、发酵时间。通过单因素实验选出料液比、pH、温度、和发酵时间四个显著影响因素，设计正交试验，优化结果得到溶栓活力最好的发酵工艺条件为:料液比10:f 15:l、pH6.5^7.5、温度37 40° C、接菌量0.5 1.0%(ν/ν)、摇床转速125 130r/min，发酵时间48 50h。本专利技术采用液体发酵的方式，具体的操作步骤为:将木豆种子粉碎按照料液比10:1 15:1加入蒸馏水浸泡一夜，调PH6.5 7.5，高温高压灭菌后按接菌量0.5 1.0%(ν/ν)接入固定化菌球，37 40° C恒温摇床培养48飞0h，转速125 130r/min，制备成纳豆激酶和木豆种子发酵体系。本专利技术以发酵后制备成的纳豆激酶与木豆种子发酵体系中激酶的溶栓活性为指标，对固定化纳豆菌菌球的稳定性，即重复使用次数进行了研究，得出该菌球稳定性良好，可以多次重复利用。本专利技术对固定化的纳豆菌菌球进行重复使用，在无菌条件下取出装有菌球的纱布袋，放入新的木豆种子液体培养基中继续发酵。当菌球活性下降到80%以下停止使用，重新固定。菌球的重复使用次数可达1(Γ15次。通过本专利技术制备出的纳豆激酶和木豆种子发酵体系，经过抽滤得到富含纳豆激酶的发酵液和发酵木豆种子膏体，将发酵的木豆种子膏体冻干、粉碎并过筛，制成发酵木豆种子粉末。基于上述的研究结果，本专利技术证实了将该固定化技术应用于制备纳豆激酶和木豆种子发酵体系可以制备出具有溶血栓功效的食品，并可将其作为功能性保健食品被推广。本专利技术的优点:1.本专利技术不同于传统的发酵方式，首次将固定化技术应用到纳豆激酶与木豆种子发酵体系的制备之中，避免了人体直接摄入纳豆菌，同时菌球稳定性能良好、易于分离、可以重复使用，避免了人体直接摄入纳豆菌，提高了产品的营养价值，节约能源。2.本专利技术以木豆种子为原料，提供了木本食用作物木豆的深加工利用技术，为木豆植物的充分利用提供新的途径，对缓解资源紧缺问题、保持水土、恢复地力、保护环境有重要意义。3.专利技术中的纳豆激酶与木豆种子发酵体系具有很好的溶栓活性，可治疗并预防血栓的形成并具有较好的溶栓功效。4.该专利技术作为保健性功能食品具有特殊的风味和良好的口感，容易被广大消费者接受和喜爱。具体实施方式 实例一海藻酸钠-氯化钙凝胶微球固定化纳豆菌(I)木豆种子液体培养基的制备:将木豆种子30g适当粉碎装入锥形瓶中，加入IOOmL蒸馏水浸泡一夜，调培养基pH6.5，高温高压灭菌后，温度恢复到室温备用；(2)固定化纳豆菌发酵木豆种子:取3.0mL纳豆菌菌液与6.0mL7.0%的海藻酸钠溶液充分混合，用注射器量取混合液滴入浓度为3.0%的氯化钙溶液当中，边滴边迅速搅拌，形成形状完好的菌球后静置2.0h，用蒸馏水冲洗干净得到平均直径为5.0_、平均重量为0.025g的菌球，装入灭菌后的纱布袋中，投入到木豆种子液体培养基中进行发酵。实例二固定化基质及发酵工艺条件的优化(I)分别配制浓度为 5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%，的海藻酸钠溶液，取3.0mL纳豆菌菌液与6.0mL上述海藻酸钠溶液分别充分混合，用注射器量取混合液滴入浓度为2.0%的氯化钙溶液当中，边滴边迅速搅拌，观察形成的菌球形状，并对其使用次数和活力进行研究，筛选最佳海藻酸钠溶液的浓度为7.0%。(2)分别配制浓度为 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，的氯化钙溶液，取3.0mL纳豆菌菌液与7.0%的海藻酸钠溶液6.0mL充分混合，用注射器量取混合液分别滴入上述浓度的氯化钙溶液当中，边滴边迅速搅拌，观察形成的菌球形状，并对其使用次数和活力进行研究，筛选最佳氯化钙溶液的浓度为3.0%。(3)将木豆种子 2.0g 粉碎，分别按照液固比 2.5:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1，加入蒸馏水浸泡一夜，调pH6.0，高温高压灭菌后按接菌量1.0%(v/v)接入固定化菌球,35° C恒温摇床培养48h,转速100r/min,制备成纳豆激酶和木豆种子发酵体系。以发酵液溶栓活性为指标，得到最佳料液比为10:1。(4)将木豆种子2.0g打碎，按照料液比10:1加入蒸馏水浸泡本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及一种固定化纳豆菌发酵木豆种子的方法，其特征在于具体步骤如下：(1)纳豆菌固定化基材的选择：分别采用活性炭、硅胶等为基材的物理吸附法，DEAE?纤维素、DEAE?葡聚糖凝胶、CM?纤维素等为基材的离子结合法，海藻酸钙、聚乙烯醇、明胶等为基材的凝胶包埋法和戊二醛交联法固定化纳豆菌；(2)液体培养基的制备：将粉碎后的木豆种子加入到蒸馏水中浸泡一夜，调整pH，高温高压灭菌后，恢复到室温备用；(3)固定化纳豆菌的发酵：将纳豆菌菌液与海藻酸钠溶液混合后滴入到氯化钙溶液当中，静置1.0~2.0h，将形成的菌球冲洗干净，投入到木豆种子液体培养基中进行发酵；(4)菌球的分离：发酵结束后，在无菌条件下取出固定化菌球，灭菌水浸泡1.0~2.0h，冲洗后投入到新的木豆种子液体培养基中继续发酵；(5)纳木豆粉和纳木豆发酵液的制备：将固定化菌球分离，并对发酵好的纳豆激酶和木豆种子体系进行抽滤，得到富含纳豆激酶的发酵液和发酵木豆种子膏体，将膏体冻干、粉碎并过筛，制成发酵木豆种子粉末；(6)发酵液和粉末溶栓活力的测定：取富含纳豆激酶的发酵液和发酵木豆种子粉末生理盐水浸泡液，用纤维蛋白平板法分别测定他们的溶栓活力，计算激酶的活力值。...

【技术特征摘要】
1.本发明涉及一种固定化纳豆菌发酵木豆种子的方法，其特征在于具体步骤如下: (1)纳豆菌固定化基材的选择:分别采用活性炭、硅胶等为基材的物理吸附法，DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素等为基材的离子结合法，海藻酸钙、聚乙烯醇、明胶等为基材的凝胶包埋法和戊二醛交联法固定化纳豆菌； (2)液体培养基的制备:将粉碎后的木豆种子加入到蒸馏水中浸泡一夜，调整pH，高温高压灭菌后，恢复到室温备用； (3)固定化纳豆菌的发酵:将纳豆菌菌液与海藻酸钠溶液混合后滴入到氯化钙溶液当中，静置1.(Γ2.0h，将形成的菌球冲洗干净，投入到木豆种子液体培养基中进行发酵； (4)菌球的分离:发酵结束后，在无菌条件下取出固定化菌球，灭菌水浸泡1.(Γ2.0h,冲洗后投入到新的木豆种子液体培养基中继续发酵； (5)纳木豆粉和纳木豆发酵液的制备:将固定化菌球分离，并对发酵好的纳豆激酶和木豆种子体系进行抽...

【专利技术属性】
技术研发人员：付玉杰，罗猛，金爽，王微，牟璠松，彭霄，顾成波，冯晨，李娜，夏欣欣，
申请(专利权)人：东北林业大学，付玉杰，
类型：发明
国别省市：