氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。本发明专利技术提供了氧化苦参碱，在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病，特别是柯萨奇病毒A16型和柯萨奇病毒B3型感染性疾病的药物的新应用。将氧化苦参碱制备得到的药物，对柯萨奇病毒感染性疾病有预料不到的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用
本专利技术属于药学领域，涉及氧化苦参碱的应用，尤其是氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。
技术介绍
氧化苦参碱(Oxymatrine)是从中药苦豆子中提取的或化学合成等途径获得的一种生物碱，其分子式为C15H24N2O2.H2O，分子量为282。无色结晶，熔点2080℃，易溶于水。氧化苦参碱是苦参的主要药理活性成分之一，具有清热、燥湿、解毒、利尿、祛风、杀虫之功效。柯萨奇病毒属于小核糖核酸病毒科肠病毒属，据其在乳鼠中引起病变的差异分为A、B两个组，A组和B组均可感染人类。经消化道传播感染人类，可引起手足口病、脑膜脑炎、心肌炎、疱疹性咽峡炎、支气管炎和腮腺炎等。目前，常用的治疗方法主要为抗病毒(利巴韦林、阿昔洛韦)、免疫调节(干扰素、免疫球蛋白)、促进心肌代谢(三磷酸腺苷、辅酶A、肌苷等)、中药治疗、对症治疗等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。特别是提供一种氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒A16型和柯萨奇病毒B3的药物的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案如下：一种氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。上述的应用中，所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物，是治疗柯萨奇病毒A16型和柯萨奇病毒B3的药物。前述的应用中，所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物，是以氧化苦参碱为原料，按常规制剂工艺，再加入相应辅料，制备成任何一种适合于临床上使用的口服或非口服剂型。前述的应用中，所述的口服或非口服剂型包括散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、口服液、糖浆剂、分散片、喷雾剂或气雾剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、吸入剂或凝胶剂。前述的应用中，所述的辅料包括常规的溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂、润滑剂、润滑剂、湿润剂、增稠剂、增溶剂和基质。与现有技术比较，本专利技术提供了氧化苦参碱，在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病，特别是柯萨奇病毒A16型和柯萨奇病毒B3型感染性疾病的药物的新应用。将氧化苦参碱制备得到的药物，对柯萨奇病毒感染性疾病有预料不到的治疗效果。以下是本专利技术的实验例：实验例1：氧化苦参碱抗柯萨奇病毒A16型和B3型的细胞实验1、Hela细胞的复苏和培养⑴实验前准备：将一次性细胞瓶、泡酸并灭菌处理后的移液管及尖头玻璃离心管、污物缸放于超净工作台台面上，开启紫外30分钟后关闭。将4℃保存的1640完全培养基放入37℃温箱中预温，并将水浴箱中的水预热至37℃。⑵将冻存于液氮中的Hela细胞迅速取出，直接投入已预热至37℃的水浴箱中，并轻轻不断摇动使其内容物在1分钟完全融化成悬液。取出冻存管，用2％新洁尔灭擦拭后放入超净工作台内，用移液管将悬液转移至一洁净尖头玻璃离心管中，加入2-3ml1640完全培养基，配平后1000rpm离心约3-4分钟，吸净上清后加入2-3ml1640完全培养基，将沉淀轻轻吹匀制成细胞悬液。⑶倒置显微镜下观察，置于37℃、5％CO2培养并每日观察复苏后的细胞生长贴壁情况，待Hela细胞长成致密单层后即可传代。⑷换液及传代：观察Hela细胞换液后贴壁生长情况良好，形态正常为多边形。2.柯萨奇病毒的活化增殖⑴将购回的CVA16(即柯萨奇病毒A16型)和CVB3(即柯萨奇病毒B3型)病毒液从液氮中取出，使其自然完全融化。⑵病毒感染细胞：在超净工作台中无菌操作将生长状态良好的单层Hela细胞培养物中的旧培养基吸弃，用1×PBS缓冲液漂洗细胞3次后加入融化后的CVA16和CVB3病毒原液，37℃孵育2小时使病毒吸附，然后将多余的病毒液吸弃，以1×PBS缓冲液漂洗3次后加入适量1640维持液，倒置显微镜下观察后37℃、5％CO2条件下培养，48小时后收集培养液。⑶收集活化增殖后的病毒液：每日观察病毒感染细胞情况，病毒成功在细胞中增殖后可见细胞出现变大变圆、脱落、出现融合细胞等细胞病变效应(CPE)，待75％以上细胞出现细胞病变，无菌操作将细胞瓶中的培养液转移至无菌尖头玻璃离心管中，3000rpm离心约3分钟后弃去沉淀保留上清液，分装至冻存管中，-20℃保存备用或冻于液氮中。3.测定CVA16和CVB3对Hela细胞的TCID50⑴将Hela细胞计数为浓度1-5×105/ml，并接种到96孔细胞板上，37℃、5％CO2培养至细胞长成单层。⑵将活化增殖后冻于-20℃备用的CVA16和CVB3病毒液自然解冻。在EP管中用RPMI-1640维持液将CVA16和CVB3病毒液以10倍梯度稀释法连续稀释成10-1-10-10。将10倍梯度稀释的CVA16和CVB3液，分别接种100μl于各Hela细胞单层培养物，每稀释度8孔。37℃孵育1小时使病毒吸附，将多余的病毒吸弃，加入100μl/孔1640维持液，37℃、5％CO2培养，逐日观察CPE并照相，连续观察3-5天(一般2-3天细胞才会出现明显CPE)，细胞病变达50％以上计为阳性。⑶按Reed-Muench方法计算CVA16的TCID50。LgTCID50＝高于50％病变率的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之间的差。距离比例＝(高于50％病变率-50％)/(>50％病变阳性率-低于50％病变率)，最后换算为TCID50/ml。病毒感染细胞后的48小时和72小时都要观察CPE并计算TCID50。4.OMT对Hela细胞的细胞毒性实验⑴将Hela细胞计数为浓度1-5×105/ml，并接种到96孔细胞板上，再加入20μl/孔用RPMI-1640稀释的不同稀释度的OMT(0.5、1、2、3、4、5、10mg/ml)或对照(细胞悬液+等量的PBS)，每个稀释度OMT各加一排，各设置3个复孔。倒置显微镜下观察后37℃、5％CO2培养48小时，并每日观察各孔细胞形态和数量的差异。⑵MTT测定：将OMT的细胞毒性测定的各孔中的上清吸弃，加入1×PBS缓冲液洗3次后轻轻扣去。避光操作加入20μl/孔5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4小时后吸净各孔内液体，加入100μl/孔DMSO终止反应。37℃静置10-15分钟，震荡摇匀，待各孔中的紫色结晶物完全溶解可观察见孔内液体呈均匀紫色。用酶标仪在492nm波长处测定每孔光吸收度值。光吸收度值与活细胞数量呈正相关。数据来自3次独立重复的实验，以表示，用SPSS19.0统计处理，各浓度OMT与对照间的比较采用成组t检验。5.OMT(即氧化苦参碱，下同)体外抗柯萨奇病毒实验⑴将Hela细胞计数为浓度1-5×105/ml，并接种到96孔细胞板上，37℃、5％CO2培养至细胞长成单层。⑵稀释OMT：用无菌蒸馏水溶解OMT，然后用RPMI-1640将浓度为125μg/ml的OMT用1:10PBS缓冲液对倍稀释后得浓度为62.5μg/ml的OMT，共得到浓度分别为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml的5个不同稀释度的rMBD-3用于抗病毒实验.⑶稀释病毒：待冻于液氮中的病毒液自然完全融化，稀释CVB3为100×TCID50，即10-3.8/0.1ml。⑷在EP管中分别先将270μl病毒液和30μl5个不同稀释度的本文档来自技高网...

【技术保护点】
氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用。

【技术特征摘要】
1.氧化苦参碱在制备治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物的应用；所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物，是治疗柯萨奇病毒A16型感染性疾病的药物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的治疗柯萨奇病毒感染性疾病药物，是以氧化苦参碱为原料，按常规制剂工艺，再加入相应辅料，制备成任何一种适合于临床上使用的口服或非口服剂型。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：江滟，沈祥春，朱荣金，牟秋菊，罗红，
申请(专利权)人：江滟，
类型：发明
国别省市：贵州;52