罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法，该方法用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－牛血清蛋白复合物免疫BALB/c小鼠，末次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存制得罗汉果甜苷V抗血清；用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－人血清蛋白复合物为包被抗原，采用间接酶联免疫吸附分析法和按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价，检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应，筛选确定罗汉果甜苷V特异性抗血清。本发明专利技术的优点是：罗汉果甜苷V特异性抗血清制备方法简单；检测罗汉果甜苷V特异性抗血清的方法可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及小分子化合物免疫化学和免疫分析技术，具体是一种罗汉果甜苷V特 异性抗血清的制备及检测方法。
技术介绍
利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的特性，定量地检测样本中微 量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。目标分析物分子免疫 学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容。 我国是中药饮片和中药提取物使用大国，传统的药物分析方法主要是依靠气相色谱(GC )、 液相色谱(HPLC )或质谱等物化分析手段，定性定量分析中药材和中药提取物有效成分的 含量。由于传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、 要求有熟练的技术人员及较长的分析周期，因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价 廉的检测技术能在实验室内和野外进行大批量的检测。免疫分析法正具备这些优点，将开 创药物分析的新纪元。
技术实现思路
本专利技术的目的是公开一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备方法，该方法工艺简 单，成本低；本专利技术的另一个目的是要为罗汉果甜苷V特异性抗血清提供一种快捷、准确的检测方法。本专利技术所述罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤1)制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯一牛血清蛋白复合物(简写为罗汉果 甜苷ν-HS-BSA)，其分子结构式为权利要求1.罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤 1)制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS - BSA，其分子结构式为2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述罗汉果苷V-HS-BSA，采用如下方法 制成1)取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的 4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；2)用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；3)取步骤2)的反应液，不分离，加入适量二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应；4)搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9， 于室温反应5小时；5)反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4°C透析，每5小时换水一次，透析3天， 经冷冻干燥，得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20°C下保存。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的BSA-碳酸缓冲液为IOmgBSA溶 于 ImlNii2CO3-NaHCO3 缓冲液。4.用权利要求1所述制备方法制备的罗汉果甜苷V的特异性抗体血清。5.一种罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的检测方法，包括如下步骤1)制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-HS - HSA，其分子结构式为6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是所述罗汉果甜苷V-HS-HSA，采用如下方 法制成1)取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的 4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；2)用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；3)取步骤2)的反应液，不分离，加入适量二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应 1Omin ；4)搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9， 于室温反应5小时；5)反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4°C透析，每5小时换水一次，透析3天， 经冷冻干燥，得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20°C下保存。7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征是所述的HSA-碳酸缓冲液为1OmgHSA溶 于 1mlNa2CO3-NaHCO3 缓冲液。全文摘要本专利技术公开了一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法，该方法用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－牛血清蛋白复合物免疫BALB/c小鼠，末次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存制得罗汉果甜苷V抗血清；用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－人血清蛋白复合物为包被抗原，采用间接酶联免疫吸附分析法和按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价，检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应，筛选确定罗汉果甜苷V特异性抗血清。本专利技术的优点是罗汉果甜苷V特异性抗血清制备方法简单；检测罗汉果甜苷V特异性抗血清的方法可靠。文档编号C07K16/18GK102146116SQ20101061450公开日2011年8月10日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日专利技术者卢曦, 李丽, 李勇文, 李芳耀, 杨新平, 林家逊, 段小群, 陈旭 申请人:桂林医学院本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．罗汉果甜苷Ｖ的特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤：　　１）制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷Ｖ－ＨＳ－ＢＳＡ，其分子结构式为：经红外光谱和紫外光谱确定其结合比比在２５．９～６１．７之间；２）动物免疫：实验动物选用雌性ＢＡＬＢ／ｃ　小鼠，实验免疫用人工抗原罗汉果甜苷Ｖ－ＨＳ－ＢＳＡ的剂量为１００μｇ／只，用ＰＨ７．２　ＰＢＳ溶液稀释抗原，首次免疫加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，２周后追加免疫加等量弗氏不完全佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，以后每隔２周腹腔注射上述浓度为２００μｇ／ｍｌ的人工抗原０．５ｍｌ，共加强免疫３次；３）抗血清的制备：末次免疫后３天摘除眼球采血，３０００ｒｐｍ离心５分钟，收集血清－２０℃保存即成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：段小群，李勇文，李丽，杨新平，卢曦，陈旭，李芳耀，林家逊，
申请(专利权)人：桂林医学院，
类型：发明
国别省市：45