针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体制造技术

本发明专利技术涉及一种针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体。针对三种甘薯病毒的融合基因序列为SEQ1，命名为SPFLG。其干涉载体构建时，先设计SPFLG-XbaI和SPFLG-SpeI以及SPFLG-KpnI和SPFLG-ClaI两对引物，将SPFLG基因克隆到T载体上，以SPFLG-T为模板，分别以两对引物进行PCR扩增，将获得的目的基因SPFLG分别用XbaI和SpeI及KpnI和ClaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlueNiRIntron载体的内含子两侧；然后利用XbaI和KpnI进行双酶切，回收目的基因的片段，将其克隆到中间载体pROK219上；用EcoRI和HindIII酶切pROKSPFLG，回收包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子的目的片段，克隆到植物表达载体pBIN19上，命名为pBINSPFLG。试验表明，本发明专利技术构建的RNA干涉载体对SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒有明显的干扰作用，为培育同时抗三种病毒的转基因甘薯奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及甘薯病毒的基因和干涉载体，属于生物工程
，特别是涉及针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体。
技术介绍
甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料和新型能源作物，近年来甘薯的用途越来越受到人们的关注。甘薯病毒病是影响甘薯生产的重要限制因素之一，病毒病的感染可造成甘薯产量下降、品质变劣和种性退化，一般可减产30%_50%。甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle ri/YAs，SPFMV)、甘薯潜隐病毒potato latent ri/YAs，SPLV)和甘薯G病毒(5’呢对potato virus G, SPVG)是危害甘薯的三种主要病毒，这三种病毒分类上都属于马铃薯Y属(/^ij^irm)病毒。在田间这几种病毒常常混合侵染，对甘薯生产造成严重危害。对甘薯病毒病目前尚无特别有效的化学防治方法，利用基因工程技术构建RNA干涉(RNAi)载体，培育抗病毒转基因甘薯是防治病毒病危害的最有效方法之一。经检索，目前还未发现利用RNA干涉技术防治甘薯病毒病危害的方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题克服现有防治甘薯病毒病的缺点，提供一种针对三种甘薯病毒的融合基因，还提供了对三种病毒有明显干扰抑制作用的RNA干涉载体。本专利技术的技术方案针对三种甘薯病毒的融合基因序列为SEQ1，命名为SPFLG。三种甘薯病毒的RNA干涉载体，其构建方法包括以下步骤(1)引物设计根据三种甘薯病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物， 具体如下SPFLG-XbaI 5' -CCTtctagaTACGAGCTGCATTCAACCAC-3’， SPFLG-SpeI 5' -AGTactagtCTGCACACCCCTCATACC-3'； SPFLG-KpnI 5'-CCTggtaccTACGAGCTGCATTCAACCAC-3，， SPFLG-ClaI 5' -AGTatcgatCTGCACACCCCTCATACC-3’ ；(2)甘薯病毒RNA干涉载体构建将权利要求1所述的SPFLG基因克隆到T载体上，命名为SPFLG-T，以SPFLG-T为模板， 分别以 SPFLG-XbaI 和 SPFLG-SpeI 及 SPFLG-KpnI 和 SPFLG-ClaI 为引物，进行 PCR 扩增，将获得的目的基因SPFLG分别用损al和RKpnl和CZaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiMntron载体的内含子两侧；然后利用损aI和^^I进行双酶切，回收含有反向重复目的基因的片段，将其克隆到中间载体PR0K219上，所述含有反向重复目的基因的片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pROKSPFLG ；用和历/7dIII酶切pROKSPFLG，回收包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子的目的片段，克隆到植物表达载体pBmi9上，命名为pBINSPFLG。所述PCR扩增反应程序为94 V预变性5min，94 V变性30s，58 V退火30s，72 °C延伸40s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。所述三种甘薯病毒为甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒。所述的RNA干涉载体在防治病毒甘薯羽状斑驳病毒、甘薯潜隐病毒和甘薯G病毒中的应用。本专利技术的积极有益效果(1)本专利技术根据SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒外壳蛋白基因核苷酸序列的保守区域设计两对引物，以质粒SPFLG-T为模板，将融合基因SPFLG以反向重复的方式克隆到pBlue MRIntron载体的内含子两侧，再将含有内含子的反向重复片段插入到中间载体pR0K219 上，将包括35S启动子、反向重复片段和NOS终止子目的片段克隆到植物表达载体PBIN19 上，成功构建了含有三种病毒CP基因保守区反向重复序列的RNA干涉载体。(2)将本专利技术的RNA干涉载体利用冻融直接转化法转入土壤农杆菌EHA105中，利用农杆菌浸润法测定了该载体对三种/^ij^irMM病毒的干扰作用。结果表明，构建的RNA 干涉载体对SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒有明显的干扰作用，农杆菌浸润后，三种病毒的含量明显减低，说明构建的RNAi载体能抑制三种甘薯病毒基因的表达。(3)本专利技术针对甘薯上普遍发生的三种病毒，成功构建了对三种病毒有明显干扰抑制作用的RNAi载体，为培育同时抗三种病毒的转基因甘薯奠定了基础。附图说明图1 目的片段SPFLG的PCR扩增图。图中，M :DL2000分子量标记，1 SPFLG PCR扩增产物。图2 pROKSPFLG经损a I和式ot I酶切验证图。图中，M :DL2000分子量标记，1 pROKSPFLG经损aI和幻7/ I酶切的产物。图 3 :pBINSPFLG经^boRI 禾口历'/ dIII 酶切验证图。M :DL2000分子量标记，1 :pBINSPFLG经&0RI和历idIII酶切的产物。图4 甘薯叶片经农杆菌浸润前后SPFMV病毒含量的变化。图5 甘薯叶片经农杆菌浸润前后SPVG病毒含量的变化。图6 甘薯叶片经农杆菌浸润前后SPLV病毒含量的变化。图4、图5、图6中，横坐标表示浸润时间，纵坐标表示样品在0D405时的吸光值，代表病毒的含量，黑色实柱表示未处理的病毒含量，白色实柱表示处理后的病毒含量。具体实施例方式实施例1 针对三种甘薯病毒的融合基因及其干涉载体 (一)材料与方法1、SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒融合基因的设计与合成分析SPFMV、SPLV和SPVG三种病毒CP基因的保守区域，各选取200 bp左右的片段， 其中SPFMV CP基因保守区l^bp，位于其CP基因的第748-945bp处；SPLV CP基因保守区189bp，位于其CP基因的第691-879bp处；SPVG CP基因保守区l^bp，位于其CP基因的第868-1065bp处。按照SPFMV-SPLV-SPVG的顺序进行融合，作为完整的目的基因，命名为 SPFLG。为了便于载体的构建，在该基因的5 ‘端引入IhI位点，在其3 ‘端引入分el位点，并各加三个保护碱基，以使酶切位点更加有效。合成的基因长度为60;3bp，基因合成后克隆到T载体上，命名为SPFLG-T。基因全序列如下1 CCTTCTAGAT ACGAGCTGCA TTCAACCACC CCTGCACGTG CAAAAGAAGC ACATTTACAG61 ATGAAGGCAG CCGCGCTTAA GAATGCGAAA AATCGGTTGT TTGGTTTGGA CGGAAACGTC121TCCACGCAAGAAGAAGATACGGAGAGGCACACGACAACTGATGTTACTAGAAATATACAT181AACCTCTTAGGAATGAGGGGTGTGCAAACATCACGCACACCCATTCGCGCCAAGGAAGCA241TACTTCCAGATGAAAGCTGTAGCGCTCACAAATACACATCATCGGCTGTTCGGTCTGGAT301GGAAATGTCTCAACCACTGAGGAAAACACCGAGCGGCATACTGCAACAGATGTGGACCGG361AACATACACACACTACTTGGAATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．针对三种甘薯病毒的融合基因，其特征在于，所述融合基因的序列为ＳＥＱ１，命名为ＳＰＦＬＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张振臣，秦艳红，张德胜，张磊，乔奇，田雨婷，郑文明，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：41