本文提供一种进行诸如基因组测序的快速DNA测序的装置和方法。该方法包括制备基因组测序样品DNA、以代表性方式扩增制备的DNA和仅以一个引物杂交步骤对扩增DNA进行多重测序反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及测定DNA碱基序列的方法和装置。更具体地，本专利技术涉及可以自动或半自动地扩增并测定基因组碱基序列的方法和装置。
技术介绍
利用自动DNA测序仪的快速和灵敏的核酸测序方法的发展已经彻底变革了现代分子生物学。通过一系列机器和一组技术人员的一致努力，现在分析植物、真菌、动物、细菌和病毒的完整基因组是可能的。但是，在短时间内对基因组进行快速和自动化或半自动化测序的目标尚不可能。继续有精确样品制备、扩增和测序的技术问题。阻碍基因组序列分析的一个技术问题是研究者不能在短时期内快速地制备包含完整基因组的众多核酸样品。另一个技术问题是不能在与当前测序方法的灵敏性相一致的水平上代表性地扩增基因组。现代经济上可行的测序机器，尽管是灵敏的，但仍然需要DNA片段的一百万以上拷贝进行测序。目前提供DNA测序高拷贝的方法涉及各种克隆或体外扩增，其不能扩增对于经济地测序全基因组所必需的个别克隆数(600，000或更多，对于人基因组是数千万)。还有另一个技术问题是目前测序方法的局限，所述方法对于寡核苷酸引物的每个杂交最多能够进行一个测序反应。测序引物的杂交通常是限制DNA测序仪通量的限速步马聚ο在大多数情况下，聚合酶链式反应(PCR ;Saiki，R. K.等人，Science 1985,230, 1350-1354 ；Mullis, K.等人，ColdSpringHarb. Symp. Quant. Biol. 1986, 51Pt 1,263-273) 在获得DNA序列信息、扩增微量特定DNA以获得足以进行测序的浓度中发挥着重要作用。然而，利用目前的PCR技术去满足日益增长的现代遗传学的需要既不经济也不有效，特别是在考虑全基因组测序的需要时。使时间和成本效益最大化的努力一般集中在两个方面减少扩增所需的反应体积以及增加 同时进行扩增的数目。微型化赋予这样的好处，样品和试剂使用降低、扩增时间减少和通量规模提高。尽管由于热块的限制传统的热循环仪需要相对长的循环时间(Woolley，Α. Τ.等人，Anal. Chem. 1996，68，4081-4086)，但较小的反应体积可以更快地进行循环。恒流 PCR装置利用连接固定温度区的蚀刻的微通道而将反应体积减少到微升以下的样品水平 (Lagally, Ε. T.等人，Analytical Chemistry 2001,73,565-570 ；Schneegas, I.等人，Lab on aChip-Tlae Royal Society of Ghernistry 2001,1,42-49)。用空气(Kalinina,0.等人，Nucleic Acids Res. 1997，25，1999-2004)或红外线 (Oda, R. P.等人，Anal. Chem. 1998，70，4361-4368 ；Huhmer, Α. F.禾口 Landers，J. P.，Anal. Cleem. 2000，72，5507-5512)加热的玻璃毛细管，也已作为纳升规模反应的有效容器而起作用。用微制作的硅热循环仪已达到相似的反应体积(Burns，Μ. Α.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1996，93，5556-5561)。在许多情况下，对于改进的电热元件(Kopp，M.U.等人，Sciencel998，280， 1046-1048 ；Chiou, J. ，Matsudaira, P. ， Sonin, A.禾口 Ehrlich， D. ，Anal. Chem. 2001，73， 2018-2021)和热空气循环仪(Kalinina，0.等人，Nucleic Acids Res. 1997，25，1999-2004) 来说，这些微型化已经把总的PCR反应时间减少到小于30分钟，而对于某些红外线控制的反应来说，减少到 240 秒(Giordano，B. C.等人，Anal. Biochem. 2001，291，124-132)。 某些技术同时采用提高的通量和微型化；如在Sasaki等设计的1536-孔系统中 (Sasaki,N.等人，DNA Res. 1997，4，387-391)，它将反应体积保持在1 μ 1以下。作为另一个例子，Nagai 等(Nagai, H.等人，Biosens. Bioelectron. 2001，16，1015-1019 ；Nagai, H.等人，Anal. Clzena. 2001，73，1043-1047)报道了单个试验片段在单一硅片中蚀刻的10,000 只86pl反应凹孔中的扩增。不幸的是，已经证明来自这些方法的扩增子的回收的利用有问题，需要通过选择性渗透膜的蒸发作用。尽管在反应体积和循环时间上有这些显著的提高，但没有一个以往的策略提供了大规模并行扩增，所述大规模并行扩增是对于将通量显著提高到完整基因组分析所需水平所必需的。DNA测序仪仍然比希望地更慢并且更贵。在纯研究环境中，如果一台测序仪缓慢并且昂贵，它有可能是可以接受的。但是当希望在临床诊断环境下利用DNA测序仪时，即使是对于经费充足的研究所来说这种低效的测序方法也是令人用不起的。数以千计克隆扩增的靶目标的大规模并行测序将极大地促进大规模全基因组文库分析，而不用耗时的样品制备过程和昂贵的易于出错的克隆过程。成功的高容量、固相、克隆DNA扩增可以用作多种用途。因此，显而易见存在着对于制备用来测序的基因组或大模板核酸、扩增所述核酸模板以及对扩增的模板核酸进行测序而无每个杂交一个测序反应的限制的需要。而且，需要一种系统将这些技术连接进一个可行的自动或半自动测序仪器中。专利技术简述本专利技术介绍了一种整合的系统，其包括用于(1)核酸样品制备，(2)核酸扩增，和 (3)DNA测序的新方法和新装置。本专利技术提供一种新方法，用于制备多种DNA序列的文库，特别是源自大模板DNA或全(或部分)基因组DNA的序列。通过片段化、补齐、衔接子连接、切口修复和单链DNA的分离由大模板DNA或完整或部分DNA基因组制备单链DNA序列。该方法提供生成与固体支持物相连的ssDNA文库，其包括(a)生成ssDNA模板文库；(b)将ssDNA模板附于固体支持物上；和(c)分离ssDNA模板所附的固体支持物。本专利技术还提供一种在单个反应管中扩增DNA文库的每个成员的方法，所述方法是通过，例如，将多个DNA样品分别包装于一种乳剂的微囊中，同时进行多个包装核酸样品的扩增，以及从微囊中释出所述扩增的多种DNA用于随后的反应来进行的。在一个实施方案中，将单拷贝的核酸模板物杂交到DNA捕获珠上，在完全扩增溶液中重悬并且乳化至微反应器(一般直径100-200微米)中，其后利用扩增(例如，PCR)来将起始模板物的拷贝数克隆增加到一个单一核酸序列的1，000，000拷贝以上，优选单一核酸序列的 2，000, 000-20, 000, 000拷贝。例如，可以用至少3，000微反应器/微升的反应混合物同时进行扩增反应，并且可以在单个100 μ 1体积的试管(例如，PCR反应管)中以超过300，000个微反应器同时进行扩增反应。本专利技术还 提供那些包含成功DNA扩增事件的珠的富集方法 (即，通过去除没有DNA附于其上的珠)。本专利技术还提供以单次本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种对核酸进行测序的方法，其包括：（ａ）核酸递送到在油包水乳剂中的水性微反应器中，从而多个水性微反应器包含单个拷贝的核酸，能够结合到所述核酸上的单个珠，和含有进行核酸扩增所必需的试剂的扩增反应溶液；（ｂ）在微反应器中扩增核酸以形成所述核酸扩增的拷贝并将扩增的拷贝结合到微反应器中的珠上；（ｃ）将所述的珠递送到平坦表面上的区域中以产生至少１０，０００个反应位点的阵列；和（ｄ）在所述反应位点，所述核酸扩增的拷贝上同时进行测序反应。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·H·利蒙，K·洛曼，J·M·罗思伯格，M·P·维纳，
申请(专利权)人：四五四生命科学公司，
类型：发明
国别省市：US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。