对核酸进行扩增和测序的方法技术

本文提供了用于进行快速ＤＮＡ测序，如基因组测序的装置和方法。该方法包括以下步骤：制备用于基因组测序的样品ＤＮＡ，以代表性的方式扩增制备的ＤＮＡ，以及在扩增的ＤＮＡ上用仅仅一个引物杂交步骤进行多个测序反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于确定DNA的碱基序列的方法和装置。更具体地，本专利技术涉及可以用于自动化或半自动化扩增和确定基因组的碱基序列的方法和装置。专利技术背景利用自动化DNA测序仪的快速和灵敏核酸测序方法的开发彻底改革了现代分子生物学。通过一系列机器和一组技术人员的协同努力，目前可以分析植物、真菌、动物、细菌和病毒的完整基因组。但是，在短时间内对基因组进行快速和自动化或半自动化测序的目标目前还不能实现。仍然存在准确样品制备、扩增和测序的技术问题。阻碍基因组序列分析的一个技术问题是研究者不能在短时间内快速制备多个包含完整基因组的核酸样品。另一个技术问题是不能代表性地扩增基因到与目前的测序方法的灵敏度相容的水平。现代经济上可行的测序仪器尽管是灵敏的，但仍然需要超过100万拷贝的DNA片段来进行测序。目前用于提供高拷贝DNA测序的方法包括克隆或体外扩增的变化形式，其不能扩增经济地对完整基因组进行测序所需数目的单个克隆(600,000或更多，对于人基因组是数千万)。还有另一个技术问题是目前测序方法的限制，对于每次寡核苷酸引物杂交，其最多可以进行一次测序反应。测序引物的杂交通常是限速步骤，其限制DNA测序仪的通量。在大多数情况下，聚合酶链反应(PCR；Saiki，R.K.，et al.，Science1985，230，1350-1354；Mullis，K.，et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.1986，51 Pt 1，263-273)在获得DNA序列信息和扩增微小量特异性DNA以获得足够测序的浓度方面起主要作用。但是，将目前的PCR技术放大以满足现代遗传学不断增加的需求，既不经济，也不有效，特别是当需要考虑完整基因组测序的要求时更是如此。使时间和经济效率最高的努力一般集中在两个方面：减少扩增所需-->的反应体积和增加同时进行的扩增的数量。小型化赋予了采用更少样品和试剂、减少扩增时间和增加通量可测量性的优点。尽管常规热循环仪由于热质量限制需要相对长的循环时间(Woolley，A.T.，et al.，Anal.Chem.1996，68，4081-4086)，较小的反应体积可以更快循环。连续流动PCR装置利用了蚀刻的微通道与固定温度区的组合，以便将反应体积减少到亚微升样品水平(Lagally，E.T.，et al.，Analytical Chemistry 2001，73，565-570；Schneegas，I.，et al.，Lab on aChip-The Royal Society of Chemistry 2001，1，42-49)。由空气(Kalinina，O.，et al.，Nucleic Acids Res.1997，25，1999-2004)或红外光(Oda，R.P.，et al.，Anal.Chem.1998，70，4361-4368；Huhmer，A.F.and Landers，J.P.，Anal.Chem.2000，72，5507-5512)加热的玻璃微毛细管也已经作为用于毫微升规模反应的有效容器。已经用微构造的硅热循环仪实现了相似的反应体积(Burns，M.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93，5556-5561)。在很多情况下，这些小型化使总PCR反应时间减少，对于改进的电热元件(Kopp，M.U.，et al.，Science 1998，280，1046-1048；Chiou，J.，Matsudaira，P.，Sonin，A.and Ehrlich，D.，Anal.Chem.2001，73，2018-2021)和热空气循环仪(Kalinina，O.，et al.，Nucleic Acids Res.1997，25，1999-2004)减少到少于30分钟，对于一些红外线控制的反应，减少到240秒(Giordano，B.C.，et al.，Anal.Biochem.2001，291，124-132)。某些技术同时利用增加的通量和小型化；如Sasaki等人的1536凹陷系统设计(Sasaki，N.，et al.，DNA Res.1997，4，387-391)，其使反应体积保持在1μl以下。作为另一个实例，Nagai等人(Nagai，H.，et al.，Biosens.Bioelectron.2001，16，1015-1019；Nagai，H.，et al.，Anal.Chem.2001，73，1043-1047)报道了在蚀刻在单个硅片中的1万个86 pl反应凹陷中扩增单个测试片段。不幸的是，已经证明从这些方法回收和利用扩增子是有问题的，需要通过选择性通透膜进行蒸发。尽管存在反应体积和循环时间的这些显著改进，以前的策略都没有提供显著将通量增加到分析完整人基因组所需的水平所需要的大规模平行扩增。DNA测序仪仍然比需要的更慢和更昂贵。在纯研究情况下，如果测序仪慢和昂贵，可能是可接受的。但是当需要将DNA测序仪用于临床诊断情况下，所述低效测序方法甚至对于财政充足的机构也是禁-->止的。数千种克隆扩增的靶的大规模平行测序将显著促进大规模的全基因组文库分析，而不需要浪费时间的样品制备过程和昂贵的易错克隆过程。成功的高容量、固相克隆DNA扩增可以用于多种应用。因此，很明确需要制备基因组或大模板核酸，用于测序、用于扩增核酸模板，和用于对扩增的模板核酸进行测序，而不存在每次杂交进行一次测序反应的限制。此外，需要用一个系统将这些多个技术连接为一个可行的自动化或半自动化测序仪。专利技术概述本专利技术描述了一种集成的系统，包括新方法和新装置，用于(1)核酸样品制备，(2)核酸扩增，和(3)DNA测序。本专利技术提供了一种新方法，用于制备多个DNA序列的文库，特别是来源于大模板DNA或完整(或部分)基因组DNA的DNA序列的文库。单链DNA的序列通过单链DNA的断裂、磨光(Polishing)、衔接子连接、切口修复和分离，从大模板DNA或完整或部分DNA基因组的样品制备。该方法提供了制备连接于固体支持物的ssDNA文库的方法，包括(a)制备ssDNA模板的文库；(b)将ssDNA模板连接于固相；和(c)分离连接了ssDNA模板的固体支持物。本专利技术也提供了通过以下步骤在单个反应管中扩增DNA文库的每个单独的成员的方法，所述步骤例如是：将多个DNA样品分别单独包封在乳状液的微胶囊中，同时进行多个包封的核酸样品的扩增，以及从<本文档来自技高网...

【技术保护点】
对靶核酸进行测序的方法，包括：ａ）将参照核酸序列转化为参照数目序列，其中参照数目序列包括理想流动图；ｂ）当一个或多个核苷酸序贯流过一个或多个拷贝的靶核酸片段时检测信号，信号相应于表明所述片段的核酸序列的询问数目序列，其中询问数目序列包括询问流动图；ｃ）在理想流动图的一个或多个位置上将询问流动图与理想流动图进行比对，其中获得询问流动图与理想流动图的近似匹配；ｄ）比较询问流动图的数目序列与理想流动图的数目序列，得到质量评分，其中质量评分表明询问流动图与理想流动图之间比对的质量；ｅ）对多个片段重复ｂ）－ｄ）的步骤；ｆ）将多个询问流动图锚定在理想流动图上相应于最高质量比对的位置上；ｇ）在一个或多个询问流动图所覆盖的理想流动图的每个位置上对一个或多个询问流动图的序列数目取平均值，从而产生包含共有区流动图的共有区数目序列；和ｈ）将共有区流动图转化为核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2005-8-1 11/195,2541. 对靶核酸进行测序的方法，包括：
a)将参照核酸序列转化为参照数目序列，其中参照数目序列包括理
想流动图；
b)当一个或多个核苷酸序贯流过一个或多个拷贝的靶核酸片段时
检测信号，信号相应于表明所述片段的核酸序列的询问数目序列，其中
询问数目序列包括询问流动图；
c)在理想流动图的一个或多个位置上将询问流动图与理想流动图
进行比对，其中获得询问流动图与理想流动图的近似匹配；
d)比较询问流动图的数目序列与理想流动图的数目序列，得到质量
评分，其中质量评分表明询问流动图与理想流动图之间比对的质量；
e)对多个片段重复b)-d)的步骤；
f)将多个询问流动图锚定在理想流动图上相应于最高质量比对的
位置上；
g)在一个或多个询问流动图所覆盖的理想流动图的每个位置上对
一个或多个询问流动图的序列数目取平均值，从而产生包含共有区流动
图的共有区数目序列；和
h)将共有区流动图转化为核酸序列。
2. 权利要求1的方法，进一步包括将理想流动图分为预定长度的重
叠的理想亚流动图，并且给理想亚流动图做索引。
3. 权利要求2的方法，进一步包括将每个询问流动图分为询问亚流
动图，每个亚流动图的长度相应于理想亚流动图的预定长度。
4. 权利要求3的方法，进一步包括检索做索引的理想亚流动图，以
确定将询问流动图与理想流动图进行比对的位置。
5. 权利要求2的方法，其中理想亚流动图是二进制编码的。
6. 权利要求3的方法，其中询问亚流动图是二进制编码的。
7. 对靶核酸进行测序的方法，包括：
a)当一个或多个核苷酸序贯流过一个或多个拷贝的靶核酸片段时
检测信号；
b)将信号与表明片段的核酸序列的询问数目序列进行关联，其中询
问数目序列包含询问流动图；
c)重复步骤a)和b)，得到多个询问流动图；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：KE麦达德，JM费罗，JR奈特，J乍鲁米林，JH利蒙，EW迈尔斯，JW辛普森，GA福尔克默，
申请(专利权)人：四五四生命科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]