本发明专利技术公开了制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法。本发明专利技术所提供的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵方法包括以下步骤：将重组菌接种于所述发酵培养基，发酵培养，得到发酵液，即得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。本方法可重复性好；菌体生长快，可大幅缩短发酵周期；菌体产量高，可满足高密度发酵需要和目标蛋白表达率高，且可溶性良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法。
技术介绍
重组白细胞介素-1受体拮抗剂(简称IL-1ra)是一种存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-1(IL-1)受体，特异性地封闭IL-1的活性。自Arend等1990年克隆出人IL-1ra的cDNA以来，各国学者都在对IL-1ra进行更为全面、深入的研究。同时，众多制药厂商也都在致力于IL-1ra的开发，2003年美国FDA批准Amgen公司生产的重组人IL-1ra(商品名Kineret)用于治疗类风湿性关节炎。我国SFDA 2008年批准西藏华西药业生产的重组人IL-1ra用于治疗眼部非感染性炎症，虽然也有厂家申请IL-1ra用于治疗类风湿性关节炎，但是至今未有产品正式上市销售。目前制备重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的方法有真核表达和原核表达两种。真核表达产量低，成本高，但蛋白活性好。原核表达(大肠杆菌)表达分包涵体表达和可溶性表达。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基。本专利技术所提供的发酵培养基，由以下成分组成：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素B1、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为：胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0.011g/L、硫酸镁0.96g/L、维生素B10.033g/L、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚0.2ml/L。本专利技术的另一个目的是提供制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法。本专利技术所提供的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤：将重组菌接种于所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。所述方法中，在所述发酵培养前，包括如下种子培养的步骤：(1)一级种子培养：将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到一级种子液；所述种子培养基A由以下成分组成：-->胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；(2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按1％接种量接入种子培养基B，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养7-8小时得到二级种子液；所述种子培养基B由以下成分组成：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为：胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。所述发酵培养的温度为37℃；所述接种量为9％-10％，具体为9％和10％；所述发酵培养中，使发酵体系的溶氧量保持在30％-50％，具体为30％、40％和50％；所述发酵体系的pH值为7.0-7.2，具体为7.0、7.1和7.2；所述发酵体系为发酵容器内的所有物质。所述发酵培养过程中，包括如下补料的步骤：在所述发酵体系的OD600达到7.0-9.0时，开始向发酵体系中补加补料培养基；所述补加的补料培养基与所述发酵培养基的体积比为1∶3；所述补料培养基由以下成分组成：酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、维生素B1和水；以上成分在所述补料培养基中浓度分别为：酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸镁5g/L、维生素B10.1g/L。所述发酵培养中，包括如下诱导培养步骤：在发酵体系的OD600值达到35-45时，向发酵体系中加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷进行诱导培养，使异丙基-β-D硫代半乳糖苷在发酵体系中的浓度为0.1mmol/L-0.2mmol/L，诱导培养的时间为3h-4h；所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。本专利技术的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法，适合重组大肠杆菌的生长和目标蛋白的表达。本工艺可重复性好；菌体生长快，可大幅缩短发酵周期；菌体产量高，可满足高密度发酵需要和目标蛋白表达率高，且可溶性良好。附图说明图1为PET-30a-IL-1Ra表达质粒构建示意图。图2为IL-1ra PCR鉴定图。图3为pET-hIL-1ra表达质粒酶切图谱图4为IL-1ra大肠杆菌表达结果。图5为IL-1ra工程菌划种LB琼脂平板的结果。图6为电镜检查IL-1ra工程菌的形态。图7为20100623批发酵SDS-PAGE电泳。-->图8为20100205批发酵菌体生长曲线图。图9为质谱分析测定IL-1ra工程菌发酵液样品的C末端序列结果。图10为EDMAN降解蛋白质N-末端氨基酸的序列分析方法测定IL-1ra工程菌发酵液样品的N-末端氨基酸的序列。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、构建IL-1ra工程菌大肠杆菌表达载体PET-30a购自Novagen公司，产品目录号：69909-3；大肠杆菌JM109菌株购自Promega公司；大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自MERCK公司；PHA刺激的人外周血T细胞cDNA文库，购自美国Clontech Laboratories.Inc。一、获得IL-1ra基因1、IL-1ra cDNA的PCR扩增以PHA刺激的人外周血T细胞cDNA文库为模板，加入合成的IL-1ra引物和dNTP，上游引物为：5′-GGCATATGCGACCCTCTGGGA-3′，下游引物为：5′-GGAGGACGAGTAAGTCGACAA-3′，上游引物引入NdeI酶切位点，从编码成熟人IL-1ra的第一个氨基酸开始，下游引物导入大肠杆菌高效终止密码TAA和SalI酶切位点。95℃5’变性后加入pfu DNA聚合酶2.5U，95℃1’，50℃1’30”，72℃1’30”一轮，经35轮反应，最后一轮72℃15’，得到的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图2所示。利用美国Promega公司的Magic PCR纯化试剂盒纯化IL-1raPCR产物。2、IL-1ra表达质粒的构建将大肠杆菌表达载体PET-30a用NdeI和SalI酶切，将步骤1的PCR产物用NdeI和SalI酶切，与上面处理好的PET-30a连接，所用连接酶为T4DNA连接酶，构建成IL-1ra表达质粒PET-30a-IL-1Ra(图1)。3、质粒酶切鉴定将表达质粒PET-30a-IL-1Ra转入大肠杆菌JM109菌株，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提纯PET-30a-IL-1Ra表达质粒，经酚抽提，乙醇沉淀后，经内切酶KpnI、SalI消化，1％琼脂糖电泳鉴定，其酶谱与预期结果一致(图3：泳道1为λDNA+Hind III分子量标准；泳道2为PET-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于制备重组白细胞介素－１受体拮抗剂的发酵培养基，由以下成分组成：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素Ｂ１、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为：胰蛋白胨３２ｇ／Ｌ、酵母粉２０ｇ／Ｌ、氯化钠０．５ｇ／Ｌ、葡萄糖２ｇ／Ｌ、十二水磷酸氢二钠１５ｇ／Ｌ、磷酸二氢钾３ｇ／Ｌ、氯化钙０．０１１ｇ／Ｌ、硫酸镁０．９６ｇ／Ｌ、维生素Ｂ↓［１］０．０３３ｇ／Ｌ、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚０．２ｍｌ／Ｌ。
【技术特征摘要】
1.一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基，由以下成分组成：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素B1、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为：胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0.011g/L、硫酸镁0.96g/L、维生素B10.033g/L、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚0.2ml/L。2.制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤：将重组菌接种于权利要求1所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列表中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵培养前，包括如下种子培养的步骤：(1)一级种子培养：将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到一级种子液；所述种子培养基A由以下成分组成：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L；(2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按1％接种量接入种子培养基B，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养7-8小时得到二级种子液；所述种子培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：揣文华，梁伟锋，韩普，王瑞琳，洪海燕，
申请(专利权)人：北京正旦国际科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11
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