糖基化谱分析制造技术

本发明专利技术提供了用于产生糖基化异源多肽的方法，其包括以下步骤：从粗发酵液中获得样品，将该样品与磁性亲和珠一起孵育，从固定的糖基化多肽中释放聚糖，测量糖基化谱，将该糖基化谱与该重组糖基化多肽的期望糖基化谱进行比较，根据获得的糖基化谱改变培养条件，以及重复该方法以获得具有期望的糖基化谱的糖基化异源多肽。使用相似的方法，可以鉴定和定量诊断标志物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】糖基化谱分析 本专利技术涉及重组蛋白及其产生的领域。更具体地，本专利技术涉及用于测定重组产生 的多肽(如抗体)的糖基化谱(glycosylation profile)的方法，以及用于产生糖基化多 肽的方法，其中在发酵过程中测定糖基化谱。
技术介绍
多肽的糖基化谱对于许多重组产生的治疗性多肽而言是一个重要的特征。糖基化 多肽(也称为糖蛋白)在真核生物(如人)和一些原核生物中介导许多重要功能，包括催 化、信号发放、细胞间通信、激活免疫系统以及分子识别和联合。它们组成了真核生物中的 大部分非胞质蛋白(Lis，H.等，Eur. J.BiOChem.218(1993)l-27)。糖蛋白上寡糖的形成/ 附着是翻译中及翻译后的修饰，因此不受遗传控制。寡糖的生物合成是多步骤过程，涉及彼 此竞争底物的多种酶。因此，糖基化多肽包含寡糖的微不均一性的排列，产生含有相同氨基 酸骨架的一组不同的糖形。 共价结合的寡糖确实影响相应多肽的物理稳定性、折叠、对蛋白酶攻击的抗性、 与免疫系统的相互作用、生物活性和药代动力学情况。此外，一些糖形具有抗原性，促使 监管机构需要对重组糖基化多肽的寡糖结构进行分析(参阅如Paulson, J.C. ， Trends Biochem. Sci. 14(1989)272-276 ;Jenkins, N.等，Nature Biotech. 14(1998)975-981)。例 如，已经报道，糖基化多肽的末端唾液酸化提高了治疗剂的血清半衰期，而包含具有末端半 乳糖残基之寡糖结构的糖基化多肽显示从循环中的清除被提高(Smith, P.L.等，J.Biol. Chem. 268(1993)795-802)。因此，在治疗性多肽(如免疫球蛋白)的生物技术产生中，对寡 糖微不均一性性及其批次间一致性的评估是一个重要的任务。 单克隆抗体(mAb)是增长最迅速的一类蛋白质治疗剂。在2005年，共有31中基 于mAb的产品被批准用于人类治疗，例如用于治疗癌症、自身免疫和炎性疾病，或用于体内 诊断，还有许多正在进行临床试验(Walsh，G. ， Trends Biotechnol. 23 (2005) 553-558)。抗 体在其糖基化模式上与其他重组多肽具有显著差异。例如，免疫球蛋白G(IgG)是对称的多 功能糖基化多肽，分子量约150kDa，由负责抗原结合的两个相同的Fab部分和用于效应子 功能的Fc部分组成。在IgG分子中糖基化通常在297位Asn处高度保守，其位于Fc重链的 CH2结构域之间，与CH2中的氨基酸残基形成广泛接触(Sutton和Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132) 。 297位Asn连接的寡糖结构被不均一地加工，使得IgG存在多种 糖形。变异存在于297位Asn位点的位点占据(宏观不均一性)或糖基化位点寡糖结构的变 化中(微不均一性性)，参阅如Jenkins,N.等，Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981 。 一 般而言，IgG mAb中更丰富的寡糖基团是脱唾液酸的双触角复合型聚糖，主要是未半乳糖基 化(agalactosylated，GO)、单半乳糖基化(Gl)或二半乳糖基化(G2)型(Jefferis，R.等， Immunol. Lett. 68(1998)47-52)。 与Fc区结合的寡糖不仅影响物理化学特性(例如结构完整性)并使蛋白酶 抗性消除或最小化，而且还是效应子功能(如补体结合、与噬菌体Fc受体结合、迅速从 循环中清除抗原-抗体复合体以及诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))所必须的(Cox，K.M.等，Nature Biotechnol. 24(2006) 1591-1597 ;Wright and Morrison, Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。由于不同的糖形可与不同的生物学特性相关， 因此，富集特定糖形的能力可用于例如阐明特定糖形与特定生物功能之间的关系。因 此，非常需要产生富含特定糖形的糖基化多肽组合物。已进行了许多研究来了解环境 因素和培养条件对蛋白质糖基化及蛋白质糖基化谱的影响。已经报道，培养变量例 如溶解氧浓度(Kunkel， J. p.等，J. Biotechnol. 62(1998)55-71)、单糖可用性的变化 (Tachibana， H.等，Cytotechnology 16 (1994) 151-157)、胞内核苷酸糖的可用性(Hills, A.E.等，Biotech. Bioeng. 75(2001)239-251)、铵浓度(Gawlitzek， M.等，Biotech. Bioeng. 68(2000)637-646)、血清浓度(Parekh， R. B.等，Biochem. J. 285 (1992)839-845 ; Serrato， J. A.等，Biotechnol. A加l. Biochem. 47 (2007) 113-124)和生长速率(Robinson, D. K.等，Biotech. Bioeng. 44 (1994) 727-735)导致糖基化谱的差异。 产生治疗用途的糖基化多肽时最常用的是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。这些细 胞产生确定的糖基化谱，并允许产生遗传稳定的高生产力细胞系。此外，它们可以高细胞密 度在无血清培养基中培养，以产生安全且可再现的生物过程。在链烷酸存在下，CHO细胞中 所表达的糖基化多肽的N-乙酰葡糖胺含量和类型受温度和摩尔渗透压浓度的影响(参阅 如US 5， 705， 364)。在美国专利申请2003/0190710中还报道，仅对温度和摩尔渗透压浓度 进行调整就可改变CH0细胞培养物中IgG糖基化重链变体的水平。 已经使用高效阴离子交换层析-脉冲安培检测法(HPAEC)和衬质辅助激光解吸与 电离-飞行时间质谱术(MALDI-T0F MS)来分析糖基化多肽的糖类部分(参阅如Fukuda， M.(编 著)Glycobiology :A PracticalApproach， IRL Press, Oxford ;Morelle， W. 禾口 Michalsky， J. C. ， Curr. Pharmaceut. Design 11(2005)2615-2645)。 Hoffstetter-Kuhn， S.等(Electrophoresis 17(1996)418-422)使用毛细管电泳和MALDI-T0F MS分析在用 N-糖苷酶F(PNGase F)使抗体去糖基化后分析单克隆抗体寡糖介导的不均一性谱。 鉴于糖基化对重组糖基化多肽功能特性的重要性以及对充分限定且一致的产品 生产过程的需要，非常需要在发酵过程中对重组产生的糖基化多肽的糖基化谱进行在线或 离线(ad-line)分析。P即ac， D.I.等(Glycobiol. 8 (1998) 445-454)报道了这样的方法， 其包括将糖基化多肽固定在聚偏氟乙烯膜上、酶消化以及糖基化谱的MALDI-T0F MS分析。 Bailey，M.等，J. Chromat. 826(2005) 177-187报道了对重组产生m本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在发酵过程中对重组产生的糖基化多肽的糖基化谱进行在线分析的方法，其包括以下步骤：（Ａ）从培养产生所述糖基化异源多肽的真核细胞的培养基中获得样品，（Ｂ）使所述样品与磁性亲和珠在适于所述异源多肽与所述珠结合的条件下接触，（Ｃ）从与所述磁性亲和珠结合的异源多肽中释放聚糖，而不从所述磁性亲和珠上释放所述异源多肽，（Ｄ）通过高效液相层析纯化（Ｃ）中释放的聚糖，（Ｅ）通过衬质辅助激光解吸与电离－飞行时间质谱分析（Ｄ）中纯化的聚糖，从而测定所述异源多肽的糖基化谱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-8-31 07017063.4用于在发酵过程中对重组产生的糖基化多肽的糖基化谱进行在线分析的方法，其包括以下步骤(A)从培养产生所述糖基化异源多肽的真核细胞的培养基中获得样品，(B)使所述样品与磁性亲和珠在适于所述异源多肽与所述珠结合的条件下接触，(C)从与所述磁性亲和珠结合的异源多肽中释放聚糖，而不从所述磁性亲和珠上释放所述异源多肽，(D)通过高效液相层析纯化(C)中释放的聚糖，(E)通过衬质辅助激光解吸与电离-飞行时间质谱分析(D)中纯化的聚糖，从而测定所述异源多肽的糖基化谱。2. 用于重组产生糖基化异源多肽的方法，其包括以下步骤(A) 提供含有编码所述异源多肽的核酸的细胞，(B) 在适于表达所述异源多肽的条件下培养所述细胞，(C) 从所述细胞的培养基中获得样品，(D) 使所述样品与磁性亲和珠在适于所述异源多肽与所述磁性亲和珠结合的条件下接触，(E) 从与所述磁性亲和珠结合的所述异源多肽中释放聚糖，而不释放所述异源多肽，(F) 纯化步骤(E)中释放的聚糖，(G) 测定所述异源多肽的糖基化谱，(H) 将所测定的糖基化谱与参照糖基化谱进行比较，(I) 根据步骤(H)所得结果调整培养条件，任选地继续进行培养和步骤(J)，或者终止 培养并获得所述糖基化异源多肽，和(J)重复步骤(C)至(H)，以获得糖基化的异源多肽。3. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述糖基化异源多肽是免疫球蛋白。4. 根据权利要求3的方法，其特征在于所述磁性亲和珠是其上结合有A蛋白、G蛋白或 L蛋白的磁性亲和珠。5. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述聚糖的释放是通过N-糖苷酶 进行的酶促释放。6. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于所述聚糖的释放是通过肼解进行 的化学释放。7. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述对释放的聚糖的纯化通过使用 反相层析树脂和/或阳离子交换层析树脂进行的高效液相层析来进行。8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述对异源多肽糖基化谱的测定通 过对释放和纯化的聚糖进行衬质辅助激光解吸与电离_飞行时间质谱分析或定量高效液 相层析分离来进行。9. 根据权利要求2的方法，其特征在于步骤(D)至(G)使用微量滴定板以高通量形式 进行。10. 根据权利要求2的方法，其特征在于所述对培养条件的调整包括对以下一种或多种的改变(i) 营养物、糖类、添加剂、缓冲剂、铵、溶解氧的浓度，或/和(ii) 摩尔渗透压浓度、pH值、温...

【专利技术属性】
技术研发人员：M哈伯格，D罗伊施，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]